Especificidade - CO-VALIDAÇÃO DO MÉTODO PARA DESENVOLVIMENTO E PRODUÇÃO DAS

4.3 CO-VALIDAÇÃO DO MÉTODO PARA DESENVOLVIMENTO E PRODUÇÃO DAS

4.3.2 Especificidade

Dentre os parâmetros avaliados num processo de validação, a especificidade é um deles.

Também conhecido por seletividade, a especificidade é um método capaz de avaliar se a substância em estudo sobre interferências de outros compostos. Ou seja, a especificidade avalia qual é o grau de interferência que os excipientes da formulação têm com o analito (BRASIL, 2003; RIBANI et al., 2004). A especificidade garante que dentro da metodologia analítica, o pico cromatográfico gerado seja exclusivamente referente a substância de interesse (BRASIL 2003).

A figura 12, ilustra a integração dos picos das NB e das NA, mostrando que não há interferência dos excipientes da NB quando o ATRA é detectado pelo equipamento, através do pico de pureza.

y = 161651x - 29021 R = 0,9999

0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000

0 5 10 15 20 25

Curva média

Figura 12 - Gráfico representativo da integração dos picos demonstrando a pureza e especificidade do método, onde A é a NA e B é a NB.

4.4 TEOR DO FÁRMACO

O teor de ATRA encontrado para as nanocápsulas carregadas com o fármaco foi de 98

%, para uma concentração de 0,5 µg/mL.

4.5 AVALIAÇÃO DA CORONA PROTEICA

De acordo com Sánchez-Moreno e cols (2015), após a administração por via endovenosa no paciente, as nanopartículas podem ter suas características de superfície modificadas devido a exposição às proteínas contidas no plasma sanguíneo. Ao se ligarem na superfície da nanoestrutura, essas proteínas formam uma coroa de proteínas a qual deu nome ao que se chama atualmente de efeito corona. A formação dessa coroa de proteínas promove, além de outras desvantagens, o rápido reconhecimento do sistema imunológico que, imediatamente, entra em ação com o objetivo de remover essas nanopartículas injetadas no organismo.

Os resultados encontrados no presente trabalho sugerem que não houve a formação de corona proteica nas suspensões de nanocápsulas utilizadas nos tratamentos. Isso fica evidenciado pelo fato dos parâmetros analisados nos testes não terem sofrido significativas alterações no decorrer dos dias em que foram feitas as análises.

4.6 ENSAIOS EXPERIMENTAIS 4.5.1 Ensaio MTT

O tetrazolium MTT amarelo (3-4-dimetiltiazolil-2)-2 e o brometo de

5-difenitretazolium são quimicamente reduzidos através da ativação da enzima desidrogenase que gera NADPH e, portanto, ele é um marcador da função mitocondrial. Assim, na presença de maior quantidade de células ou de maior viabilidade a reação do MTT produz uma coloração roxa que pode ser quantificada por espectrofotometria. Valores de absorbância mais baixos que o controle, indicam redução na taxa de proliferação celular. Ao contrário, valores de absorbância mais altos indicam aumento na proliferação celular (MOSMANN, 1983).

A figura 13 mostra os resultados do MTT do ATRA em sua forma livre após 24 e 72 horas de incubação, com resultados expressos em porcentagem em relação ao controle.

Figura 13 - Ensaio de viabilidade celular pelo MTT com 24 e 72 h de incubação, figuras 13A e 13B, respectivamente.

Os resultados foram expressos em porcentagem do controle negativo (100%). Sendo NC o Controle negativo:

células em meio de cultura e H2O2 (peróxido de hidrogênio) controle positivo. Os dados foram expressos com média ± desvio padrão (D.P.). As análises foram realizadas por variância (ANOVA) de 1 via, seguida por teste post hoc de Tukey. Os valores com p<0.05 foram considerados estatisticamente significativos. Sendo *p < 0,05,

**p < 0,01 e ***p < 0,001.

Os resultados evidenciados na figura 13 mostram que o AL se apresentou citotóxico e antiproliferativo em todas as suas concentrações testadas (p < 0,001) quando comparado ao controle negativo.

A figura 14 mostra os resultados do MTT das NA após 24 e 72 horas de incubação, com resultados expressos em porcentagem em relação ao controle.

Figura 14 - Ensaio de viabilidade celular pelo MTT com 24 e 72 h de incubação, respectivamente figura 14C e

14D.

Os resultados foram expressos em porcentagem do controle negativo (100%). Sendo NC o Controle negativo:

**p < 0,01 e ***p < 0,001

Quando testadas as diferentes concentrações de NA, percebeu-se nas 24 horas que não houve citotoxicidade das mesmas em relação ao controle negativo. Mas nas 72 horas, as mesmas concentrações mostraram um padrão antiproliferativo (p < 0,001) quando comparada ao controle negativo.

A figura 15 mostra os resultados do MTT da NB após 24 e 72 horas de incubação, com resultados expressos em porcentagem em relação ao controle.

Figura 15 - Ensaio de viabilidade celular pelo MTT com 24 e 72 h de incubação, respectivamente figura 15E e

15F.

Os resultados foram expressos em porcentagem do controle negativo (100%). Sendo NC o Controle negativo:

**p < 0,01 e ***p < 0,001.

A figura 15, acima, mostra diferentes concentrações de NB testadas. Nas 24 horas de incubação, não foram detectados nenhum padrão de citotoxicidade, pois todas concentrações não apresentaram diferença estatística significativa em relação ao controle negativo.

Nas 72 horas, as três maiores concentrações (1,5; 2 e 2,5 µM) apresentaram atividade antiproliferativa em relação ao controle negativo, indicando diminuição da viabilidade celular.

4.5.3 Avaliação da taxa de produção de radicais livres

Em 2003, Sauer e cols propuseram um método capaz de avaliar a presença de espécies reativas no interior das células através da adição de uma susbtância chamada 2,7 diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA) a qual, no citoplasma, pode ser desacetilada por esterases e reduzida para diclorodihidrofluoresceína (DCFH). A DCFH, por sua vez, quando em contato com espécies reativas do oxigênio, acaba por ser convertida para diclorofluoresceína (DCF). A DCF pode ser facilmente visualizada, devido a sua forte fluorescência.

O conteúdo de espécies reativas ao oxigênio é diretamente proporcional à intensidade de fluorescência captada pelo aparelho bem como do potencial antioxidante da substância que foi testada, o ATRA (BARRY et al., 2004).

A figura 16 abaixo mostra os resultados do ensaio da diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA), após 24 horas de incubação, com resultados expressos em porcentagem em relação ao controle. Observa-se que, em todas as concentrações analisadas, o AL e a NA

apresentaram altas taxas de espécies reativas, quando comparadas com as células não tratadas.

Porém, quando comparamos o AL com a NA percebemos uma redução nas taxas de ERMOS produzidas, principalmente nas concentrações de 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 µM, verificando uma diminuição do desbalanço oxidativo celular.

Vários fármacos utilizados nos tratamentos quimioterápicos, atuam no processo de destruição tumoral através da formação de radicais livres. Por exemplo, estudos com adriamicina (ADR), a qual é um fármaco utilizado no tratamento de diversas neoplasias e que tem como fator limitante a miocardiotoxicidade, têm demonstrado que este efeito citotóxico é mediado pela produção de radicais livres durante o metabolismo intracelular (BALIS et al., 1989). Estudos feito também por Li e cols (2000) demonstraram que, em ratos tratados com ADR ocorria um aumento do estresse oxidativo.

Figura 16 - Ensaio da diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA) para avaliação dos níveis de produção de radicais livres, após 24h de incubação.

ATRA livre 24h

Os resultados foram expressos em porcentagem do controle negativo (100%). Sendo NC o controle negativo:

células em meio de cultura. Os dados foram expressos com média ± desvio padrão (D.P.). As análises foram realizadas por variância (ANOVA) de 1 via, seguida por teste post hoc de Tukey. Os valores com p<0.05 foram

considerados estatisticamente significativos. Sendo *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001.

A figura 17 abaixo mostra os resultados do ensaio da diclorofluoresceína diacetato DCFH-DA com células, após 72 horas de incubação, com resultados expressos em porcentagem em relação ao controle. Ao compararmos o AL nas 24 e nas 72 horas após a incubação, não se pode perceber significativas alterações com relação as taxas de produção de ERMOS. Porém, ao compararmos as taxas de ERMOS produzidas pelas NAs, percebe-se que a produção diminui consideravelmente após 72 horas de incubação, em comparação com 24 horas. Observa-se ainda um padrão estatístico observado no comportamento das NBs tanto para 24 quanto para 72 horas, onde não ocorrem significativas modificações na produção de ERMOS.

Figura 17 - Ensaio da DCFH-DA com células para avaliação dos níveis de produção de radicais livres, após 72h

Os resultados foram expressos em porcentagem do controle negativo (100%). Sendo NC o controle negativo:

considerados estatisticamente significativos. Sendo *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001.

A figura 18 abaixo mostra os resultados do ensaio da DCFH-DA com sobrenadante, após 72 horas de incubação, com resultados expressos em porcentagem em relação ao controle.

De acordo com Aranda e cols (2013), em testes colorimétricos e fluorimétricos realizados para avaliar estresse oxidativo utilizando nanoestruturas, ocorre que em alguns nanomateriais, há adsorção dos corantes sobre a superfície e com isso podem ser atenuadas ou alteradas as propriedades de fluorescência. Pesquisadores já relataram a interferência de diversos tipos de nanopartículas com a emissão de fluorescência da DCFH-DA. De encontro a estes fatos, Kroll e cols (2012) sugeriram que para serem evitadas essas alterações, modificações nos protocolos poderiam ser feitas, afim de descartar valores equivocados, advindos somente da interferência dos constituintes da nanopartícula.

Por isso, realizou-se também, neste trabalho, a análise apenas do sobrenadante no protocolo da DCFH-DA, após 72 horas. Foi possível perceber que, em comparação com a análise celular realizada também após 72 horas de incubação, houve uma considerável diminuição da produção de ROS em todas as concentrações, para todos os tipos de tratamento.

Possivelmente, isso se dê devido ao fato de que os constituintes da nanocápsula possuem atividade própria, mesmo quando da ausência do fármaco. Sugere-se que a composição da nanocápsula emite fluorescência e consequentemente gera também produção de ERMOS (ARANDA et al., 2013).

Figura 18 - Ensaio da DCFH-DA com células do sobrenadante para avaliação dos níveis de produção de radicais livres, após 72h de incubação.

Sobrenadante ATRA livre 72h

Os resultados foram expressos em porcentagem do controle negativo (100%). Sendo NC o controle negativo:

considerados estatisticamente significativos. Sendo *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001.

4.3.5 Análise do Ciclo Celular

O gráfico da figura 19 representa os resultados encontrados para o ciclo celular das células NB4 expostas aos tratamentos com AL, NA e NB, nas concentrações de 1,5; 2,0 e 2,5 µM e após 72 horas de incubação.

Figura 19 - Análise do Ciclo Celular.

G0/G1 S

Exposição das células NB4 aos tratamentos com AL, NA e NB nas concentrações de 1,5; 2,0 e 2,5 µM, em comparação ao controle de células (NC). Tempo de exposição de 72 horas.

O ciclo celular de células tumorais geralmente é desregulado. Isso se dá devido à instabilidade genômica e às alterações cromossomais que essas células costumam apresentar, associadas ainda à alta atividade proliferativa que as mesmas possuem (SOUZA, 2014).

De acordo com os resultados encontrados na análise do ciclo celular, observou-se, com

relação ao AL, na fase G0/G1 (48%) contagem de células abaixo do controle negativo (100%).

Nas fases S (154%) e G2/M (105%) do ciclo celular, a contagem de células tratadas com AL foi superior ao controle negativo (100%). Sugere-se que o AL, dentre outros agentes terapêuticos, atua induzindo a célula a entrar em senescência, ou seja, o ATRA induz a diferenciação celular e prossegue o ciclo, até atingir a senescência para posterior ativação da cascata de apoptose (SOPRANO et al., 2004; VANGESTEL et al., 2009).

Provavelmente, a parada em G1 ocorre para que a célula possa corrigir a fusão PML/RARα e somente após as células voltarem a condição de normalidade é que o ciclo de divisão continua, conforme observamos no gráfico em S e G2/M. O motivo pelo qual observa-se alta contagem celular no tratamento com AL nos períodos S e G2/M é devido a capacidade do ATRA em diferenciar a célula rapidamente, tornando-a normal.

Conforme afirma Gianni e cols (2000), o ATRA possui também efeito em LPA pois pode induzir a parada do ciclo celular ou induzir a maturação das células que desencadeiam a apoptose, por via das caspases (GANNI et al., 2000). Logo, após as células voltarem a condição de normalidade, possivelmente estas continuam o ciclo celular até que, em um determinado momento, a via das caspases seja ativada e o processo apoptótico aconteça.

Com relação à NA e a NB, observou-se no ciclo celular um padrão semelhante para os dois tipos de tratamentos. Ambos demonstraram contagem de células acima do controle negativo nas fases G0/G1 (318% NB e 309% NA) e S (194% NB e 185% NA). Porém entre os períodos G0/G1 e G2/M a contagem de células apresenta um declínio e quando observamos a fase G2/M, percebe-se que tanto a NA quanto a NB apresentam níveis de contagem de células muito inferiores ao controle negativo, 25% e 28%, respectivamente. Sugere-se, a partir disso que ambos os tipos de tratamento (NA e NB) ocasionam um atraso no ciclo das células NB4 na fase G1 do ciclo celular.

Provavelmente, a NA libera o ATRA de maneira mais gradativa e isso possibilita às células tumorais mais tempo para se diferenciarem em células normais. O fato da NA ocasionar um bloqueio, provavelmente se deve ao fato de que, no ciclo celular, em determinados pontos de controle, pode ser aumentado o período de reparo para o dano celular (SOUZA, 2014).

Sob condições de dano, os mecanismos de controle das células bloqueiam o ciclo celular nas fases G1, S, G2 e M, prevenindo erros de replicação (G1 e S) e mitose (G2 e M), estresse osmótico, produção de espécies reativas de oxigênio, dano à maquinaria celular e senescência (SOUZA, 2014).

Quando ocorre um dano, imediatamente as células ocasionam um bloqueio temporário do ciclo celular, para que possa ser realizado o reparo. Porém, quando não é possível reparar o

dano, proteínas específicas do ciclo celular ativam o mecanismo de morte celular programada (PAULOVICH et al., 1997).

Bloqueando o ciclo celular nas fases G1 ou G2, diminui-se o número de células tumorais, assim como as células podem ficar mais tempo expostas aos efeitos nocivos de uma terapia combinada (WU et al., 2013). Várias moléculas também vêm sendo pesquisadas, com o intuito de inibir proliferação celular nas fases de transição de G1/S e GS/M (CARNEY et al., 2012). Souza (2014) também afirma que, sempre que houver dano, os mecanismos de controle celular irão bloquear o ciclo nas fases G1 e S (a fim de prevenir erros de replicação) e nas fases G2 e M (a fim de prevenir erros na mitose).

Verificamos também que as NBs possuem o mesmo comportamento das NAs. Sabe-se que existe uma maior permeabilidade e tempo de retenção das nanocápsulas em células tumorais, mas estudos adicionais necessitam ser realizados para explicar tal mecanismo evidenciado. Baseados nisso, diversos estudos têm mostrado o potencial das nanopartículas como sistemas carreadores de fármacos antitumorais. Para que o efeito de permeabilidade e retenção aumentada seja efetivo, é necessário que o sistema nanoestruturado apresente uma circulação prolongada na corrente sanguínea, possibilitando maior acúmulo na região tumoral (MOONEY, 2005; TORCHILIN, 2011).

4.3.6 Análise da expressão gênica

Foram utilizados 6 primers para análise da expressão gênica, os quais todos foram comparados com o gene endógeno GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase), que é frequentemente utilizado como controle em reações de RT-qPCR, para expressão gênica (SCHNEIDER, 2014). Este gene é utilizado para estudos de regulação e expressão gênica e achados recentes demonstram que o GAPDH está envolvido em diversos processos celulares, como por exemplo, reparo do DNA, replicação do DNA e apoptose (BARBOSA, 2007).

No que diz respeito ao papel do GAPDH no processo de morte celular, seu envolvimento está relacionado ao estresse oxidativo (BARBOSA, 2007). Nos processos tumorais, sabe-se que o GAPDH tem papel fundamental no início do processo de formação tumoral e por isso esse gene é diferencialmente expresso em células tumorais. Quando é utilizada a quimioterapia, os níveis expressos de GAPDH diminuem consideravelmente, em decorrência do efeito de alguns fármacos utilizados no coquetel quimioterápico (BARBOSA, 2007).

A figura 20 representa os resultados, em escala logarítmica, da expressão do gene alvo BAX frente às diferentes concentrações dos tratamentos AL, NA e NB.

Figura 20 - A figura 20A representa a expressão do gene BAX e a figura 20B a gene Bcl-2.

Exposição das células NB4 aos tratamentos com ATRA livre, ATRA nanoencapsulado e nanocápsulas brancas, nas concentrações de 1,5; 2,0 e 2,5 µM, em comparação ao controle de células. Expressão relativa (Log2 RQ).

Os resultados expressos em média ± desvio padrão (DP) através do cálculo da concentração relativa dos valores (ΔΔCT) utilizando o programa de informática StepOne™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems®).

De acordo com os resultados expressos no gráfico, observa-se que o gene BAX foi expresso em todas as concentrações testadas em NA e nas concentrações de 1,5 e 2,0 µM tratadas com NB. Para todas as concentrações de AL e para a concentração de 2,5 µM da NB não houve expressão gênica durante o teste.

Bcl-2 é uma família de genes que compreende aproximadamente 25 genes codificantes, dos quais BAX e Bcl-2 são os genes mais importantes envolvidos nos eventos apoptóticos e aparecem de diferentes maneiras regulando o ciclo celular. BAX é um exemplo de proteína pró-apoptótica; Bcl-2 é um exemplo de proteína antiapoptótica. Esses genes, associados a outros tipos de proteínas da mesma família, podem determinar se a célula responde ao estímulo de apoptose ou não (CORY e ADAMS, 2002). Por isso, foram testados outros genes envolvidos na via extrínseca de apoptose (via das caspases) para melhor compreensão dos resultados encontrados.

BAX é um gene envolvido no processo de morte celular, o qual tem ação pró-apoptótica pois participa da via mitocondrial de apoptose (CESCATO, 2010). De acordo com a figura 20A, a ausência de expressão do gene BAX em todas as concentrações tratadas AL e na concentração de 2,5 µM tratada com NB sugere que as células não entraram em processo apoptótico por esta via intrínseca.

A figura 20B representa os resultados, em escala logarítmica, da expressão do gene alvo Bcl-2 frente às diferentes concentrações dos diferentes tratamentos AL, NA e NB.

De acordo com os resultados expressos na figura 20B, observa-se que o gene Bcl-2 foi expresso em todas as concentrações para todos os tipos de tratamento, exceto na concentração de 1,5 µM quando o tratamento foi com NB. Na concentração de 2,5 µM da NA e na

concentração de 2,0 µM da NB a expressão do gene Bcl-2 foi extremamente baixa.

A ausência de expressão do gene BAX e a considerável expressão do gene Bcl-2 quando as células foram tratadas com AL demonstra que o ATRA na forma livre induz de maneira potencial à apoptose. De encontro a isso, há de se considerar que, a ausência de expressão do gene PML/RARα em todas as concentrações de AL sugere que as células tumorais tenham sido diferenciadas para células normais e programadas para entrar em apoptose.

A figura 21 representa os resultados, em escala logarítmica, da expressão dos genes por via das caspases frente às diferentes concentrações dos diferentes tratamentos AL, NA e NB.

Figura 21 - Expressão gênica dos genes caspase-1 (A), caspase-3 (B) e caspase-8 (C).

De acordo com os resultados expressos na figura 21A observa-se que as caspases 1, 3 e 8 foram expressas em todos os tipos de tratamento e em todas as concentrações. Nos resultados expressos na figura 21B, observa-se que a caspase-3 seguiu o mesmo padrão de expressão gênica encontrado nos resultados para a caspase-1 (figura 21A). Observou-se uma diminuição

A B

na expressão da caspase-3 na concentração de 2,5 µM quando tratada com a NA e nas concentrações de 1,5 e 2,0 µM tratadas com NB. Na concentração de 1,5 µM do tratamento com a NA houve também uma diminuição na expressão da caspase-3.

A figura 21C representa os resultados, em escala logarítmica, da expressão do gene alvo caspase-8 frente às diferentes concentrações dos diferentes tratamentos (AL, NA e NB). Assim, com os resultados expressos, observa-se que a caspase-8 seguiu o mesmo padrão de expressão gênica encontrado nos resultados para a caspase-3. Observou-se uma diminuição na expressão da caspase-8 na concentração de 2,5 µM quando tratada com a NA e nas concentrações de 1,5 e 2,0 µM tratadas com NB. Na concentração de 1,5 µM do tratamento com a NA houve também uma diminuição na expressão da caspase-8.

Deste modo, percebe-se que o efeito potente do AL contra células de LPA é porque este tipo de leucemia é a única entre as leucemias mieloides que apresentam alta sensibilidade para ATRA. Em LPA o AL induz tanto a parada do ciclo celular quanto a maturação das células que desencadeiam a apoptose dependente das caspases por via extrínseca (GIANNI et al., 2000).

Quando o ATRA é nanoencapsulado percebe-se uma alteração da via apoptótica em

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