Trissomia 21 vs Controlos no 1º trimestre de gravidez

Para a análise da trissomia 21 do 1º trimestre, amostras de plasma de mulheres grávidas saudáveis (controlos, n=15) e de grávidas que tiveram fetos com T21 (n=7) no 1º trimestre de gravidez foram extraídas e os extratos lipídicos foram analisados por RMN de 1H. A mesma estratégia aplicada para a análise das amostras de DMG foi aplicada na análise de T21, isto é, os espetros de RMN de 1H foram alinhados e normalizados utilizando os métodos de normalização PQN e área total e submetidos análise multivariada com diferentes tipos de “scaling”, UV, Pareto e centrado. No final desta análise foi escolhido como o melhor modelo aquele com normalização PQN e “scaling” UV.

Na Figura 35 encontra-se representada a análise multivariada do 1º trimestre dos espectros de extratos lipídicos obtidos por RMN de 1H. A Figura 35 a) representa o modelo de PCA com normalização PQN e “scaling” UV de controlos e T21, onde podemos concluir que não há separação entre os dois grupos. A Figura 35 b) representa o modelo de PLS-DA, onde conseguimos obter uma boa separação entre o grupo controlos e T21, com um valor de Q2 igual a 0,433. As Figuras 35 c) e 35 d) revelam os resultados obtidos pelo método de validação de MCCV, que demostram a pobreza do modelo na classificação das classes, com valores de sensitividade, especificidade e taxa de classificação iguais a 38,1%, 86,3% e 69,5%, respetivamente. No gráfico de ROC (Figura 35 c)) podemos observar que as classes não estão bem separadas uma vez que existe dispersão intra-classes e as classes verdadeiras (●) e permutadas (○) encontram-se muito próximas umas das outras. No gráfico de distribuição dos valores de Q2 existe muita sobreposição entre as classes verdadeiras (■) e as classes permutadas (□).

78 Figura 35. Análise multivariada de controlos (símbolos pretos (n=15)) e T21 (símbolos vermelhos (n=7)) com normalização PQN. a) PCA de coordenadas fatoriais com “scaling” UV (R2X= 0,62, Q2= 0,433); b) PLS-DA de coordenadas fatoriais com “scaling” UV (R2X= 0,214, R2Y= 0,716, Q2= 0,401); c) Gráfico de ROC; d) Gráfico de distribuição dos valores de Q2.

De seguida fez-se seleção de variáveis do modelo com normalização PQN acima representado. As Figuras 36 a) e b) representam os modelos de PLS-DA antes e após a seleção de variáveis. Analisando os modelos podemos observar que estes são muito semelhantes. Ao comparar os valores de Q2 dos modelos concluímos que a seleção de variáveis melhorou o modelo uma vez que aumentou o valor de Q2. As Figuras 36 c) e d) representam os gráficos ROC e distribuição de Q2 obtidos pelo método de validação de MCCV. Com a seleção de variáveis, os valores de sensitividade, especificidade e taxa de classificação sofreram um ligeiro aumento, assumindo valores de 49,9%, 90,0% e 77,3%, respetivamente. Comparando os gráficos de ROC e de distribuição dos valores de Q2 com os gráficos obtidos antes da seleção de variáveis (Figura 35 c) e d)) podemos concluir que

79 a seleção de variáveis melhorou a classificação das classes. No gráfico de ROC (Figura 36 c)) as classes verdadeiras encontram-se agora mais afastadas das classes permutadas e mais próximas do 1. No gráfico de distribuição dos valores de Q2 (Figura 36 d)) a seleção de variáveis diminuiu a sobreposição entre as classes verdadeiras e permutadas.

Figura 36. Análise multivariada de controlos (símbolos pretos (n=15)) e T21 (símbolos vermelhos (n=7)) com normalização PQN. a) PLS-DA de coordenadas fatoriais com “scaling” UV (R2

X= 0,214, R2Y= 0,716, Q2= 0,401) antes da seleção de variáveis; b) PLS- DA de coordenadas fatoriais com “scaling” UV (R2X= 0,326, R2Y= 0,697, Q2= 0,438); c) Gráfico de ROC após seleção de variáveis; d) Gráfico dos valores da distribuição de Q2 após seleção de variáveis.

Após a validação dos modelos foi feita a análise das contribuições fatoriais da informação contida no LV1, componente que explica maior variação de dados no modelo de PLSD-DA. A Figura 37 representa o modelo de contribuições fatoriais de PLS-DA, colorido de acordo com os valores de VIP, com “scaling” UV para normalização PQN antes (a) e depois (b) da seleção de variáveis, onde podemos notar que não existem diferenças entre os dois gráficos de contribuições fatoriais. Os picos com coloração mais

80 intensa representam as ressonâncias com maior importância, sendo estas: os fosfolípidos (+N(CH3)3, fosfolípidos CH2-+N(CH3)3, glicerolfosfolípido (C(3)H2) e fosfolípidos (PO-

CH2) em LV1 positivo.

Figura 37. Gráficos dos contribuições fatoriais colorido de acordo com os valores de VIP, dos modelos de PLS-DA com “scaling” UV antes (a)) e depois (b)) da seleção de variáveis.

De seguida passou-se à análise univariada. Após a integração das ressonâncias que mais variam entre os dois grupos em estudo, foram calculados valores de p utilizando o teste de Wilcoxon. Para as ressonâncias que apresentaram valores significativamente diferentes foram calculados o effect size para as médias padronizadas e a percentagem de variação. Os resultados desta análise se encontram representados na Tabela 21.

81 Tabela 21. Resultados da análise univariada de T21 vs. controlos (a nível de significância 95% (p <0.05); t=tripleto, s = singleto e m=multipleto).

Desvio químico /ppm (multiplicidade)

Composto

T21 (n=7) vs. Controlos (n=15) Valor de pa % variação Effect size

0,88-0,90 (t) Ácidos gordos CH₃ - - - 1,20-1,40 (s) Ácidos gordos (CH₂)_n - - - 2,24-2,34 (m) Ácidos gordos CH₂CO - - - 2,74-2,79 (m) Ácidos gordos 18:2 =CH-CH₂-CH= - - - 5,29-5,46 (m) Ácidos gordos –HC=CH- - - - 1,00-1,01 (s) Colesterol C(19)H 3 - - - 3,22-3,41 (s) _{Fosfolípidos} +_N(CH 3)3 (de fosfatidilcolina e esfingomielina) 7,6E-04 -10,7±3,4 -1,2±0,7 3,67-3,88 (s) Fosfolípidos CH2- + N(CH3)3 (de fosfatidilcolina e esfingomielina) 4,8E-04 -9,6±13,7 -0,3±0,6 3,88-4,02 (s) Glicerolfosfolípido C(3)H₂ 1,3E-04 -10,6±3,0 -1,4±0,7 4,32-4,45 (m) Fosfolípidos PO-CH₂ 4,2E-02 -13,8±10,1 -0,6±0,6 4,08-4,18 (m) Esqueleto de glicerol dos _{triglicéridos C(1)H}

2

- - -

4,25-4,32(m) Esqueleto de glicerol dos _{triglicéridos C(3)H}

2

- - -

Observando a Tabela 21 podemos concluir que apenas as ressonâncias pertencentes a classe dos fosfolípidos é que variam (valor de p >0,05) e todas variam no sentido negativo, significando que estas ressonância encontram-se diminuídas no grupo T21 quando comparado com o grupo controlo. Das ressonâncias acima listadas, os fosfolípidos PO- CH2 apresentam maior variação, com um valor de % de variação igual a 13,8%.

Analisando os valores do effect size podemos ver que para todas as ressonâncias este valor possui um erro associado muito elevado, o que significa que as diferenças entre os grupos de T21 e controlos são menores que as diferenças existentes dentro do mesmo grupo.

A Figura 38 representa as caixas de bigodes obtidas pela análise univariada, das ressonâncias que apresentam diferenças entre o grupo de T21 e o grupo controlo.

82 Figura 38. Caixas de bigodes dos valores dos integrais das ressonâncias com diferenças significativas entre controlos e T21.

Observando as caixas de bigodes podemos verificar que a variação nos fosfolípidos PO-CH2 (Figura 38 d)), entre os grupos controlos e T21, não é muito significativa visto

existir sobreposição entre as caixas de bigodes dos dois grupos. Nas Figuras 38 a), 38 b)e 38 c), a variação entre os dois grupos já é mais significativa havendo menos sobreposição entre os grupos.