Utilização de candidatos de RNAi para induzir o silenciamento transcricional em células

O gene Foxp3 é essencial no desenvolvimento de células T regulatórias (Treg), tanto induzidas como naturais. Essa característica é comum para humanos e camundongos (319). Considerando-se ambas Treg naturais, ou Treg induzidas (iTreg), seu desenvolvimento está ligado especificamente a expressão e estabilidade do Foxp3, o qual pode ser regulado por fatores de transcrição, modificações pós-transcricionais e mecanismos epigenéticos, Sendo que esses mecanismos diferenciam as populações de Treg e controlam o fenótipo imunossupressor (211,226,229,320).

Neste trabalho, demonstramos que é possível induzir o silenciamento transcricional (TGS) no Foxp3 de células Treg induzidas in vitro. Mostramos que existem duas regiões gênicas que são susceptíveis ao silenciamento transcricional por candidatos de RNA, o que pode constituir uma alternativa de imunoterapia específica para inibir as Treg em câncer. As duas regiões caracterizam-se por ser altamente conservadas entre espécies como camundongo e humano (conforme nossa análise figura 5) e possuir uma alta quantidade de CpG (Figura 5, Tabela 1). A primeira região é o promotor que contém a TATA box. a CAAT box e o sítio de início da transcrição. Além disso, o promotor tem vários sítios de ligação a fatores de transcrição indispensáveis para a expressão do gene. Esta região foi a que apresentou um maior número de candidatos TGS-RNAi eficientes para diminuir a expressão do Foxp3 (Figura 7B).

Inicialmente, para efetuar a veiculação de TGS-RNAi para células alvo, utilizamos vetores virais recombinantes derivados de lentivírus, que apresentam um alto nível de segurança e grande eficiência para modificação genética de células primárias. É interessante observar que nosso grupo tem larga experiência e expertise na manipulação destes vetores virais. Sendo assim, após efetuar a clonagem dos candidatos realizamos ensaios in vitro, obtendo como resultado alguns candidatos com alto desempenho, conforme descrevemos anteriormente. O melhor candidato de TGS-RNAi dirigido à região promotora de

imunossupressor, validado em ensaios realizados em cultura de células (Figura 7B). Quando foram feitas as análises de metilação, observou-se que o candidato PS5 causava um efeito de indução da metilação de 66.7% no promotor (Figura 10). Dados da literatura sugerem que o promotor está amplamente regulado epigenéticamente e que esse é um pré-requisito para a expressão estável de

Foxp3 e por tanto do fenótipo imunossupressor (227,230,321). O status

epigenético do gene Foxp3 foi proposto como um marcador a mais para diferenciar células T regulatórias pelo Sakaguchi (211) e já está sendo usado na clínica (322). Para compreender melhor o papel fundamental de Foxp3 e a sua regulação epigenética podemos nos referir ao fato de que as células T regulatórias podem ser divididas em três populações tanto pelo processo de diferenciação celular quanto pela origem e pelo status de metilação do TSDR e o promotor. Células Treg naturais apresentam uma desmetilação completa no TSDR e no promotor, porém, células induzidas na periferia perdem a metilação total e ganham algumas CpGs metiladas. Isso serve como controle das Treg dado que se o estimulo desaparecer essas células perdem o fenótipo imunossupressor. Contudo, as mais instáveis em termos de metilação são as Treg induzidas in vitro, já que estas podem estar parcialmente metiladas nas nossas regiões alvo (201). Conforme podemos observar na Figura 10, as iTreg sem vírus e com vírus controle apresentaram uma metilação de 33% o que pode estar no limite para ainda permitir a expressão do gene, porém sem muita estabilidade. A partir de 50% de metilação já é possível ver uma queda nos níveis de FOXP3 o que foi observado como efeito dos nossos candidatos de RNAi para TGS.

A segunda região que foi explorada neste trabalho foi o CNS2 ou TSDR, uma região que foi encontrada como desmetilada diferencialmente em células Treg e que possui a maior quantidade de CpGs dentro do gene. O silenciamento desta região pelo candidato TS6 mostrou diminuição no nível de FOXP3 para todas as estratégias de entrega testadas (Figura 8A, 13). Conforme a figura 10, podemos observar que o candidato TS6 apresenta o maior índice de metilação de 87,3%, o que pode explicar seu bom desempenho. É interessante observar que a análise de metilação foi feita apenas em sítios alvo escolhidos na região promotora de Foxp3, lembrando que o candidato TS6 foi dirigido à região TSDR,

cerca de 18.000 bases distante deste sítio. Por esta razão, também estamos realizando novos ensaios para verificar o perfil de metilação induzido na região do TSDR, por todos os candidatos de TGS-RNAi e controles. Alterações nos padrões de metilação desta região estão ligados à síndrome IPEX-like, que constitui um fenótipo parecido com o produzido quando existe a ausência total de FOXP3 (323). Além disso, foi demostrado que essa sequência intrônica ajuda a manter a homeostase e limitar doenças autoimunes protegendo a identidade das Treg e mantendo a estabilidade do Foxp3 e interagindo com o promotor via o fator NFAT por médio de um loop (324). Esse último aspecto pode ser essencial para entender os nossos resultados das análises de metilação e função imunossupressora, uma vez que segundo nossos resultados experimentais, os nossos candidatos contra o TSDR poderiam induzir a metilação no TSDR podendo interferir também na região do promotor e favorecendo assim a metilação dessa região.

O grupo do Dr. Alexander Rudensky do Memorial Sloan Kettering - EUA, tem desenvolvido vários trabalhos mostrando o papel do TSDR na regulação do

Foxp3, mostrando que apesar de ser dispensável para a indução inicial do

FOXP3, é requerido para a progênie das células, já que o mesmo FOXP3 se une a esta região fazendo dela um modulo de memória que facilita a herança da linhagem de Treg (222). O TSDR pode ser visto como um mediador da estabilidade da linhagem de Treg, atuando como um sensor de STAT5, o fator de transcrição associado a IL2, mantendo a expressão de Foxp3 durante a divisão das Treg e evitando a ação de citocinas pro-inflamatórias que poderiam levar a perda de FOXP3 (325). A inativação do Foxp3 leva a inativação do fenótipo imunossupressor contra células efetoras CD8+ como foi observado na figura 9, usando os candidatos TS6, TI2 e PS5.

5.2 Diferentes estratégias de veiculação de candidatos para TGS baseadas