sementes de Pinus taeda L. Experimentos IV e V
Para o experimento que se utilizou como substrato papel filtro (PF), meio água-amido (AM) e meio água-amido-ágar (AG+AM) como substratos, não ocorreram diferenças estatísticas significativas para a germinação. Esta ocorreu em 1,43% das sementes inoculadas nos meios solidificados com amido e ágar+amido. O meio de papel filtro apresentou germinação zero. Essas taxas podem ser consideradas muito baixas em relação aos experimentos anteriores.
A ausência de germinação no meio papel filtro deve-se à ausência de água neste, decorrente da autoclavagem, a qual diminuiu o teor de água do papel, seguido da temperatura de incubação das UEs. A água não foi reposta para evitar contaminações externas.
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Não ocorreram diferenças significativas para as contaminações bacterianas nos tratamentos testados. Bactérias foram observadas apenas no meio solidificado com amido, onde contaminaram 1,43% das sementes.
Quanto à contaminação fúngica, o tratamento papel filtro apresentou-se superior ao tratamento água-amido, porém, não diferiu estatisticamente do tratamento água+amido+ágar. Porém, não é possível confirmar a superioridade, neste caso, do uso do papel filtro, devido à ocorrente ausência de umidade, já citada anteriormente, o que pode reduzir a ocorrência de bactérias. A Tabela 4 mostra os dados obtidos através das análises estatísticas.
TABELA 4 Percentual de germinação, contaminação fúngica e bacteriana de sementes de
Pinus taeda L. nos meios alternativos para o cultivo in vitro: Papel Filtro,
Água+Amido de Milho (AM) e Água+Ágar+Amido de Milho (AG+AM). Santa Maria, UFSM, 2007.
Variáveis Observadas
Substrato Germinação (%) Fungos (%) Bactérias (%)
Papel Filtro 0 a* 0 a 0 a
Água + Amido 1,43 a 8,6 b 1,43 a
Água+Amido+Ágar 1,43 a 1,43 a b 0 a
CV (%) 4,87 8,99 3,46
* Médias seguidas pela mesma letra na coluna, não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
A utilização de amido como solidificante e desse combinado com agar, são metodologias viáveis na substituição do ágar como solidificante em cultura de tecidos, porém, a técnica mostrou-se mais demorada e com dificuldades de elaboração. Diferente do ágar, o qual quando misturado ao meio em temperatura elevada apresenta-se em estado líquido, o amido misturado à água, ou ainda combinado com ágar, apresenta-se muito consistente, o que dificulta as dosagens em para vertê-lo nos frascos. Além disso, conforme reduz a temperatura, ocorre à formação de grumos que também dificultam de forma significativa os procedimentos, implicando em maior tempo de manipulação.
No decorrer do experimento, observou-se que o meio de cultivo solidificado com amido ou amido e agar (Anexo B) mantiveram sua consistência, servindo como solidificante e suporte para as sementes (Figura
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4). A redução na germinação em comparação ao experimento anterior possui, possivelmente, relação com a capacidade do meio em reter água e a relação deste evento com o fornecimento hídrico essencial à germinação das sementes. Caldas et al. (1998) citam que meios muito consistentes podem limitar a difusão de água e nutrientes para os explantes que estão sendo cultivados.
Erig et al. (2004) testaram a utilização de amido de milho e amido de mandioca, em diversas combinações com água e ágar, como solidificantes alternativos na multiplicação in vitro de Malus domestica. Os autores consideraram, do ponto de vista de multiplicação, a possibilidade de substituição do ágar por amido de milho, o qual se igualou-se ao agar, como costuma ser utilizado na rotina laboratorial, em todos os aspectos referentes às variáveis que foram observadas.
Cultivos in vitro de anteras de cevada e tubérculos de batata apresentaram resultados satisfatórios quando se substituiu o solidificante do meio por amido. Porém, observar o aspecto físico do meio durante o decorrer dos experimentos é muito importante, já que algumas plantas liberam in vitro a enzima amilase, capaz de degradar o amido, gerando perda da consistência (CALDAS et al., 1998).
A vermiculita, associada a meio MS líquido e o meio MS solidificado com ágar, acrescido de carvão ativado (Anexo C), não mostraram diferenças significativas, levando-se em consideração a variável contaminação fúngica. Em contrapartida, observaram-se diferenças em relação às variáveis germinação (Tabela 5) e contaminação bacteriana (Tabela 6), as quais permitiram concluir sobre a utilização destes dois meios alternativos.
TABELA 5 Análise da Variância para os tratamentos MS+Vermiculita e MS+Carvão ativado
referentes à variável germinação onde se observa: causa de variação (CV), graus de liberdade (GL), soma dos quadrados (SQ), quadrado médio (QM) e teste F (F). Santa Maria, UFSM, 2007.
CV GL SQ QM F
Tratamentos 1 0,0245 0,0245 4,29*
Resíduo 38 0,2171 0,0057
Total 39 0,2416
* teste F significativo com 0,05
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TABELA 6 Análise da Variância para os tratamentos MS+Vermiculita e MS+Carvão ativado
referentes à variável contaminação bacteriana onde se observa: causa de variação (CV), graus de liberdade (GL), soma dos quadrados (SQ), quadrado médio (QM) e teste F (F). Santa Maria, UFSM, 2006.
CV GL SQ QM Teste F
Tratamentos 1 0,0358 0,0358 21,04*
Resíduo 38 0,6388 0,0168
Total 39 0,9926
* teste F significativo com 0,05
A germinação em meio líquido contendo vermiculita com suporte para as sementes, foi superior estatisticamente a germinação em meio com ágar e carvão ativado (Figura 3). Além disso, é possível observar que, em relação aos experimentos in vitro anteriores, a maior média de germinação até o momento ocorreu em vermiculita com meio MS líquido. Esse fato deve-se à maior disponibilização de água do meio para a semente, proporcionando a embebição inicial necessária e, posteriormente, a ativação de metabólitos que auxiliarão na germinação. Meios líquidos podem não favorecer a respiração do explante sem a presença de um suporte. Nesse caso, a vermiculita serviu como suporte aos explantes.
A afirmativa do parágrafo anterior está de acordo com Caldas et al (1998), que relatam que meios sólidos são mais eficientes no fornecimento de sais para as plantas, tendo em vista que, em experimentos de cenoura utilizando meio líquido, percebeu-se um aumento na concentração de água e redução na concentração de sais em seus tecidos. Possivelmente, este fato tenha favorecido a germinação das sementes de Pinus taeda, já que sementes necessitam maior fornecimento de água em comparação à disponibilidade de sais para iniciar o processo germinativo. Caldas et al (1998) também citam que vermiculita promove maior aeração do meio e, por este motivo, favorece o enraizamento.
Testes de germinação com Adenanthera pavonina demonstraram que o substrato de vermiculita ofereceu ótimas condições para os estudos de germinação da planta, comparando-se a outros citados, como papel filtro e algodão (FANTI e PEREZ, 1999).
Em relação à variável contaminação bacteriana, o meio líquido contendo vermiculita também foi superior ao meio MS com solidificante e carvão, o qual teve 33,31% de contaminação. Em todos os experimentos in vitro, até o
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momento, não havia sido utilizada sacarose. Assim, pode-se concluir que a significativa incidência de bactérias tenha forte relação com a disponibilidade de carboidratos presentes no meio.
0 5 10 15 20 25 30 35 E s c a la P e rc e n tu a l 1 2 Germinação (1) e Contaminação Bacteriana (2) MS+V MS+C 8,33 33,31 0 0
FIGURA 3 Porcentagens de Germinação (1) e Contaminação Bacteriana (2) em Meio MS
líquido tendo como suporte vermiculita (MS+V) e meio MS solidificado com ágar acrescido de carvão ativado (MS+C). Santa Maria, UFSM, 2007.