Validação da expressão gênica por qRT-PCR

A fim de validar os dados de microarray, realizamos PCR quantitativo em tempo real quantitativo (qRT-PCR) para genes que foram considerados críticos

para a avaliação dos efeitos do carbaril e da radiação solar. O qRT-PCR é comumente usado para este fim por apresentar maior sensibilidade quantitativa da expressão gênica (Provenzano & Mocellin, 2007). A Figura 21 mostra a expressão relativa dos genes CDKN1A (p21), CCNE1, GADD45A, GADD45B, EXO1, BRCA1, BRCA2, S100A10, MITF, MDM2, PCNA, CYP1A1 e HMOX1.

De modo geral, os dados do microarray foram consistentes com os resultados da qRT-PCR para todos os genes, com exceção de S100A10, MITF e CYP1A1. Após análise estatística, foi possível confirmar um efeito aditivo entre o carbaril e a radiação solar com relação aos genes CCNE1 e GADD45B, e um efeito aparentemente sinergístico com relação à expressão dos genes BRCA1, BRCA2, CDKN1A e MDM2. A hiperexpressão dos genes PCNA, GADD45A e EXO1 parece ser um efeito exclusivo da radiação solar, já que não diferença estatística entre a expressão no grupo de tratamento combinado e no grupo exposto à radiação solar isolada. Da mesma maneira, a subexpressão de MITF e a hiperexpressão de HMOX1 são exclusivos ao tratamento com carbaril, uma vez que não há alteração significativa da expressão entre o grupo de tratamento combinado e o grupo tratado apenas com o inseticida. Assim, foi confirmada uma resposta mais acentuada no grupo de tratamento combinado carbaril + radiação solar com relação a alguns genes de dano ao DNA e regulação do ciclo celular, e que a radiação solar não induziu resposta detectável a estresse oxidativo.

Com relação à diferenciação, os resultados foram menos expressivos no ensaio de qRT-PCR que no ensaio de microarray. A expressão do gene

S100A10 avaliada pelo ensaio de validação foi nula em todos os grupos de tratamento em relação ao controle (Figura 21).

Com relação ao metabolismo de xenobióticos, os resultados foram inconsistentes, já que o perfil de expressão do gene CYP1A1 não foi reproduzido pelo ensaio de qRT-PCR. As discrepâncias entre os dois ensaios ocorre principalmente porque o ensaio de microarray não é preciso com relação à quantificação da expressão, e também pela ocorrência de artefatos nas lâminas de cDNA que podem provocar resultados falso-positivos ou falso- negativos.

Figura 21: Validação da expressão gênica por qRT-PCR - comparação entre resultados dos ensaios de microarray e PCR quantitativo em tempo real. Dados gerados em triplicata experimental, analisados por ANOVA seguida de teste de Tukey, comparados ao grupo controle DMSO (*p<0,05, **p<0,001). Grupos identificados pela mesma letra não diferem significativamente. UV _{– tratado com DMSO 0,07% e} irradiado com 375mJ/cm2 _{de radiação solar; Carb UV – tratado com carbaril 100µM e}

irradiado com 375mJ/cm2 _{de radiação solar; Carb – tratado com carbaril 100µM; e}

5 Análise da regulação do ciclo celular

O ensaio de microarray revelou alteração em diversos genes responsáveis pela regulação do ciclo celular nos diferentes tratamentos. A Figura 22 mostra que no grupo tratado com carbaril e com radiação solar, houve uma redução significativa no número de células na fase G0/G1 e um aumento significativo no número de células na fase S, enquanto que o número de células na fase G2 permaneceu inalterado, demonstrando que as células neste grupo experimental parecem ter interrompido o ciclo celular na fase S. No grupo tratado apenas com carbaril há também um aumento de células na fase S que, embora menos significativo, não difere significativamente do grupo de tratamento combinado. A hiperexpressão de MDM2 encontrada nos ensaios de expressão gênica é consistente com os resultados de parada de ciclo celular principalmente no grupo combinado, uma vez que esse gene induz à parada de ciclo celular e checkpoint na fase S frente a estímulos genotóxicos (Deb et al., 2014). Adicionalmente, a análise da proteína Ciclina B1 por Western Blot revelou aumento da expressão proteica nos grupos tratados com carbaril (Figura 23). Tipicamente, a ciclina B1 apresenta pico de expressão na transição entre as fases G2 e M, e apresenta aumento linear durante a fase S do ciclo celular (Hwang et al., 1995). Em 1997, Katula et al. descreveram que em células tumorais as ciclinas são capazes de ativar os promotores de outras ciclinas, provocando uma expressão extemporânea das mesmas; por exemplo, a hiperexpressão de ciclina E pode levar a um aumento da expressão da ciclina B1 na transição entre as fases G1 e S, e essa expressão precoce de ciclinas mitóticas pode perturbar a progressão do ciclo celular, contribuindo para o processo de transformação. Mais recentemente, Moore et al. (2014)

demonstraram que o complexo cdk1-ciclina B1 possui capacidade de promoção da fase S quando é translocado do citoplasma para o núcleo celular. Assim, a expressão de ciclina B1 nos melanócitos tratados com carbaril é consistente com o aumento no número de células na fase S e pode ser indicativa de uma desregulação do ciclo celular.

Figura 22: Avaliação de ciclo celular por citometria de fluxo - melanócitos humanos após 48 horas de tratamento. Dados gerados em triplicata experimental, analisados por ANOVA seguida de teste de Tukey, comparados ao grupo controle DMSO (*p<0,05, **p<0,0001). DMSO UV – tratado com DMSO 0,07% e irradiado com 375mJ/cm2 _{de radiação}

solar; Carb UV – tratado com carbaril 100µM e irradiado com 375mJ/cm2

de radiação solar; Carb – tratado com carbaril 100µM; e DMSO – tratado com DMSO 0,07%.

Figura 23 - Análise da expressão relativa da proteína Ciclina B1 (55 Kda) em melanócitos primários humanos após 24 horas de tratamento. O gráfico indica a porcentagem de expressão proteica em relação ao controle não tratado e não irradiado. Para o controle interno de proteína constitutiva foi utilizada a Vinculina (116Kda). Dados correspondem a uma duplicata experimental e foram comparados ao grupo controle DMSO. DMSO UV – tratado com DMSO 0,07% e irradiado com 375mJ/cm2 _{de radiação solar; Carb UV – tratado com carbaril 100µM e irradiado com}

375mJ/cm2 _{de radiação solar; Carb – tratado com carbaril 100µM; DMSO – tratado}

com DMSO 0,07%; e Ctrl NT – nenhum tratamento.

6 Curva de crescimento celular

A Figura 24 mostra a curva de crescimento dos melanócitos humanos tratados com carbaril e/ou radiação solar analisada pelo ensaio do Azul de Tripan. É possível observar que em todos os grupos experimentais há um crescimento celular linear ao longo do tempo com exceção dos grupos tratados com carbaril, onde nota-se que o número total de células se mantém constante durante todo o período de tratamento. A diminuição na taxa de proliferação

Vinculina Ciclina B1

celular foi significativa, porém não há diferença estatística entre o grupo tratado apenas com carbaril ou tratado com carbaril associado à radiação solar. Pode- se inferir que o aumento do número de células na fase S nos grupos tratados com carbaril não está relacionado a um aumento na taxa de proliferação celular, confirmando que o inseticida provoca parada de ciclo celular.

Figura 24: Curva de crescimento celular - contagem celular realizada após 24, 48 e 72 horas de tratamento. Dados gerados em triplicata, analisados por ANOVA seguida de teste de Tukey, comparados ao grupo controle DMSO. DMSO UV – tratado com DMSO 0,07% e irradiado com 375mJ/cm2 _{de radiação solar; Carb UV – tratado com carbaril 100µM e}

irradiado com 375mJ/cm2 _{de radiação solar; Carb – tratado com carbaril}

100µM; e DMSO – tratado com DMSO 0,07%.

7 Análise dos mecanismos de morte celular e autofagia

A fim de analisar se há diferenças no mecanismo de morte celular entre os diferentes tratamentos, realizamos um ensaio de detecção de fosfatidilserina (marcação por Anexina) por citometria de fluxo. Nas Figuras 25 e 26, podemos notar que houve redução significativa no número de células

marcadas somente por Anexina e marcadas duplamente por Anexina e PI. Os resultados sugerem que há uma diminuição nas taxas de apoptose e apoptose tardia nos grupos tratados com carbaril, mas não no grupo tratado apenas com a radiação solar, onde houve um aumento no número de células em necrose.

Figura 25: Avaliação do mecanismo de morte celular por citometria de fluxo - melanócitos humanos tratados por 24 horas de tratamento. Dados gerados em triplicata experimental, analisados por ANOVA seguida de teste de Tukey, comparados ao grupo controle DMSO (*p<0,05, **P<0,001). DMSO UV _{– tratado com DMSO 0,07% e irradiado com} 375mJ/cm2 _{de radiação solar; Carb UV – tratado com carbaril 100µM e}

irradiado com 375mJ/cm2 _{de radiação solar; Carb – tratado com carbaril}

Figura 26 - Representação por Dot Plots da análise do mecanismo de morte celular por citometria de fluxo: os quatro gráficos à esquerda mostram a caracterização fenotípica da população de células, selecionadas de acordo com o tamanho (parâmetro FSC-A) versus a complexidade celular (parâmetro SSC-A). Os quatro gráficos à direita apresentam a porcentagem de células viáveis (Anexina-/IP-) no quadrante inferior esquerdo, células apoptóticas (Anexina+/IP-) no quadrante superior esquerdo, células em apoptose tardia (Anexina+/IP+) no quadrante superior direito e células necróticas no quadrante inferior direito (Anexina-/IP-). DMSO UV – tratado com DMSO 0,07% e irradiado com 375mJ/cm2 _{de radiação solar; Carb UV – tratado}

com carbaril 100µM e irradiado com 375mJ/cm2 _{de radiação solar; Carb – tratado}

com carbaril 100µM; e DMSO – tratado com DMSO 0,07%.

A ausência de níveis significativos de morte celular por apoptose no grupo tratado apenas com radiação solar está de acordo com dados publicados por Marrot et al. (2005) que demonstraram que melanócitos humanos caucasianos apresentam morte celular limitada, principalmente por apoptose, mesmo quando expostos a altas doses de radiação solar (1200mJ/cm2 _{de UVB}

e 11000 mJ/cm2 de UVA; Marrot et al., 2005). A inibição da apoptose nos grupos tratados com carbaril é surpreendente, considerando a ausência de aumento de morte celular por necrose, interrupção do ciclo celular na fase S e inibição da proliferação. Logo, optou-se por investigar se as células nesses

grupos teriam adotado a autofagia como mecanismo de sobrevivência. Sabe-se que espécies reativas de oxigênio podem regular a morte celular tanto por apoptose quanto por autofagia, dependendo do local onde ocorrem e do nível de estresse oxidativo, envolvendo a modulação de fatores de transcrição como Nrf2, NFKB e p53 (Kaminskyy & Zhivotovsky, 2014). Além disso, é importante lembrar que uma das respostas encontradas no ensaio de microarray foi a alteração dos genes ULK1, ATG16L1 e COPE associados a autofagia nos grupos tratados com carbaril (Figura 17).

Assim, investigamos a expressão das proteínas relacionadas à autofagia Beclin-1 e LC3B por Western Blot, após 24 horas de tratamento. Na Figura 27 podemos observar que a proteína LC3B encontra-se nitidamente aumentada nos grupos tratados com carbaril, sugerindo que a via de autofagia tenha sido ativada pelo tratamento com o inseticida. Embora esse aumento não tenha sido estatisticamente significativo, o mesmo é consistente principalmente com a inibição do mecanismo de morte celular por apoptose. De fato, há uma íntima relação entre os processos apoptótico e autofágico, em que caspases exercem um papel de interruptor na ativação de uma dessas duas vias de sinalização e consequente inibição da outra (Wu et al., 2014). Além disso, a autofagia pode ser ativada em resposta a dano ao DNA e estresse oxidativo, contribuindo para a estabilidade genômica por meio da eliminação de micronuclei e partes danificadas de DNA (Vessoni et al., 2013). A proteína LC3B, também conhecida como Atg8, é um importante marcador de autofagia, por estar envolvida na etapa final de formação de autofagossomos (Liu et al., 2013). A proteína Beclin-1, por sua vez, não encontra-se alterada pelos diferentes

tratamentos (Figura 28). Essa proteína é um reconhecido regulador da via autofágica, e dependendo de seus ligantes, pode estar associada à ativação ou inibição da autofagia (Sahni et al., 2014). Se de fato for comprovado que há indução de autofagia nos grupos tratados com carbaril, é possível que em 6 horas de tratamento sua expressão já tenha retornado a níveis basais nesses grupos, já que a Beclin-1 atua nas fases mais iniciais da ativação do processo autofágico (Cao & Klionsky, 2007). Ensaios complementares são necessários para investigar a ativação da via autofágica nos grupos tratados com o inseticida carbaril.

Figura 27 - Análise da expressão relativa da proteína LC3B-II (14, 16Kda) em melanócitos primários humanos após 24 horas de tratamento. O gráfico indica a porcentagem de expressão proteica em relação ao controle não tratado e não irradiado. Para o controle interno de proteína constitutiva foi utilizada a Vinculina (116Kda). Dados correspondem a uma triplicata experimental, analisados por ANOVA seguida de teste de Tukey, comparados ao grupo controle DMSO. DMSO UV _{– tratado} com DMSO 0,07% e irradiado com 375mJ/cm2 _{de radiação solar; Carb UV – tratado}

com carbaril 100µM e irradiado com 375mJ/cm2 _{de radiação solar; Carb – tratado com}

carbaril 100µM; DMSO – tratado com DMSO 0,07%; e Ctrl NT – nenhum tratamento. Vinculina

Figura 28 - Análise da expressão da proteína Beclin-1 (60Kda) em melanócitos primários humanos após 24 horas de tratamento. O gráfico indica a porcentagem de expressão proteica em relação ao controle não tratado e não irradiado. Para o controle interno de proteína constitutiva foi utilizada a Vinculina (116Kda). Dados correspondem a uma unicata experimental. DMSO UV – tratado com DMSO 0,07% e irradiado com 375mJ/cm2 _{de radiação solar; Carb UV – tratado com carbaril 100µM e irradiado com}

375mJ/cm2 _{de radiação solar; Carb – tratado com carbaril 100µM; DMSO – tratado}

com DMSO 0,07%; e Ctrl NT – nenhum tratamento.