Validação de métodos

O desenvolvimento de um método analítico ou a adaptação e implementação de um método já conhecido na rotina de um laboratório exige a verificação de sua eficiência. Este processo de verificação, chamado validação, é realizado para garantir que o método é exato e reprodutível sobre uma faixa específica em que a substância de interesse será analisada. Segundo a ANVISA (2003), a validação deve garantir, através de estudos experimentais, que o método atende às exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados.

Os parâmetros normalmente avaliados na validação de métodos são: seletividade, linearidade e faixa de aplicação, precisão, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação e robustez. A seletividade do método está relacionada com a sua capacidade de avaliar as substâncias em análise, de forma inequívoca, na presença de componentes que podem interferir na sua determinação em uma amostra complexa. Este parâmetro pode ser obtido de várias maneiras, sendo mais usual a comparação entre a matriz isenta da substância de interesse e a matriz adicionada da mesma substância, sendo que nenhum sinal deve interferir no sinal gerado pela mesma (Ribani et al., 2004).

A linearidade corresponde à capacidade do método de fornecer resultados diretamente proporcionais à concentração do analito, dentro de uma faixa de aplicação (Ribani et al., 2004). Este parâmetro é avaliado pela construção de uma curva analítica dos sinais obtidos em função da concentração da substância. Os resultados devem ser analisados por métodos estatísticos adequados, como o método de regressão linear, que proporcionem estimativas matemáticas do grau de linearidade do método. Um mínimo de 5 concentrações é recomendado para determinação da linearidade (ICH, 1996). A faixa de aplicação corresponde ao intervalo entre o valor superior e inferior da concentração da substância em exame, que atenda aos requisitos de precisão e exatidão. Para produtos

formulados, a ICH (1996) recomenda o estudo de linearidade em uma faixa de concentração com variação de ± 20 % em relação ao valor esperado.

A precisão representa a dispersão dos resultados entre ensaios independentes repetidos para uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões, sob condições definidas, e geralmente é expressa como a estimativa do desvio padrão relativo (RSD %). A precisão de métodos é considerada em três níveis: repetibilidade, precisão intermediária e reprodutibilidade. A repetibilidade está relacionada com a concordância entre os resultados de medidas sucessivas de um mesmo método nas mesmas condições, realizadas pelo mesmo analista, com o mesmo equipamento, no mesmo local e em um curto espaço de tempo. A

International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH, 1996) e a ANVISA (2003)

recomendam que a repetibilidade seja verificada a partir de um mínimo de nove repetições do mesmo procedimento (por exemplo, três repetições em três níveis diferentes), ou a partir de um mínimo de seis determinações de uma concentração similar ao valor esperado. A precisão intermediária indica as variações aleatórias que podem ocorrer dentro das circunstâncias em que o método será empregado, como diferentes dias de análise, diferentes analistas ou distintos equipamentos. O número de ensaios segue as mesmas recomendações do cálculo de repetibilidade (ICH, 1996; ANVISA, 2003). A reprodutibilidade refere-se aos resultados de ensaios em colaboração entre diferentes laboratórios e deve ser considerada no caso de padronização de um procedimento analítico para inclusão em farmacopeias, CODEX, etc. A IUPAC recomenda que resultados de oito laboratórios devam ser utilizados para os ensaios de reprodutibilidade (Thompson et al., 2002).

A exatidão do método representa o grau de concordância dos resultados obtidos experimentalmente com um valor de referência aceito como verdadeiro. Este parâmetro é sempre considerado dentro de um intervalo de confiança, que é mais estreito em níveis de concentração elevados e mais amplo em níveis de traços do composto em estudo. A exatidão de um método pode ser avaliada

através da análise de materiais de referência certificados (CRM), por comparação com outros métodos validados, por testes de recuperação ou ainda pelo método de adição padrão. Os CRM são fornecidos por órgãos reconhecidos como o NIST (National Institute of Standards and Technology) e contêm uma concentração certificada de uma determinada substância, com o grau de incerteza associado. Os resultados da análise do CRM obtido no laboratório devem ser comparados com o valor certificado para verificação da exatidão do método. A determinação da exatidão por comparação de métodos consiste na comparação dos resultados do método que se pretende validar com um método de referência, avaliando o grau de proximidade entre os resultados. A exatidão obtida por ensaios de recuperação consiste na adição de concentrações conhecidas do analito a uma amostra isenta da substância, onde a recuperação é definida como a proporção desta substância que é extraída e passível de ser quantificada pelo método. O método de adição padrão é empregado para determinação da exatidão quando não é possível produzir um branco da matriz sem a amostra de interesse. De acordo com este método, concentrações conhecidas do analito são adicionadas na matriz, que já contém concentrações desconhecidas da substância. As amostras sem adição do padrão e com adição do padrão em diferentes níveis são analisadas e as concentrações medidas são relacionadas com a quantidade adicionada (Ribani et al., 2004).

O limite de detecção (LD) representa a menor concentração do analito que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada pelo método analítico. O limite de detecção pode ser determinado de três maneiras: pelo método visual, pelo método da relação sinal-ruído ou ainda, através de parâmetros da curva analítica. O método visual determina o LD pela adição de concentrações conhecidas do analito à matriz de maneira que se diferencie o ruído e o sinal analítico produzido pelo analito pela visualização da menor concentração visível. A relação sinal-ruído só pode ser empregada para métodos que apresentam o ruído em sua linha de base e é realizada pela comparação de sinais medidos a partir de amostras contendo baixas concentrações conhecidas do analito com os sinais do

branco. A partir desta comparação é estabelecida a concentração mínima a partir da qual o analito pode ser detectado. O LD também pode ser estimado a partir da curva analítica construída para a avaliação da linearidade do método e é expresso como:

S s x

LD =3,3

onde s é a estimativa do desvio padrão da resposta (que pode ser a estimativa do desvio padrão do branco, da equação da linha de regressão ou do coeficiente linear da equação) e S é a inclinação ou o coeficiente angular da curva analítica (ICH, 1996; Ribani et al., 2004).

O limite de quantificação (LQ) corresponde à menor concentração da substância estudada que pode ser medida com precisão e exatidão aceitáveis, utilizando determinado método analítico. Os mesmos critérios empregados para determinação do LD também podem ser adotados para o LQ, ou seja, o cálculo pode ser realizado pelo método visual, pela relação sinal-ruído ou pelos parâmetros da curva analítica. Quando calculado pelo método da curva analítica, o LQ é expresso como:

S s x

LQ =10

de acordo com os mesmos parâmetros empregados para cálculo do LD (ICH, 1996; Ribani et al., 2004).

A robustez de um método analítico expressa sua resistência a mudanças produzidas nos resultados quando ligeiras alterações são realizadas em suas condições experimentais, ou seja, um método robusto é aquele que não é afetado por pequenas modificações deliberadas em seus parâmetros (Thompson et al., 2002). Desta forma, a robustez é avaliada pela introdução de pequenas variações no procedimento analítico como a mudança de equipamentos, analista, marca ou concentração de reagentes, pH de soluções, temperatura de reação e a verificação de seus efeitos na produção dos resultados. Uma ferramenta bastante utilizada para avaliação da robustez é o teste de Youden, onde são realizados oito ensaios com uma combinação fatorial dos efeitos e verifica-se qual efeito ou combinação de efeitos que implicam em variações no resultado final (Thompson et al., 2002; Ribani et al., 2004).

O NIST disponibiliza 3 diferentes CRM para avaliação da exatidão de métodos quantitativos de carotenoides em alimentos: purê processado de espinafre (SRM 2385; NIST 2012), extrato de cenoura em óleo (SRM 3276; NIST 2009) e um preparado de alimento para bebês (baby food, SRM 2383; NIST 2000). O purê processado de espinafre fornece concentrações certificadas de luteína (incluindo seus ésteres) e β-caroteno, com valores de incerteza de 20 e 15 % para estes carotenoides, respectivamente. O extrato de cenoura em óleo determina valores somente para alguns carotenos: all-trans- β-caroteno, cis-β- caroteno totais, β-caroteno total (cis+trans) e all-trans-α-caroteno (incerteza de 23, 32, 23 e 17 %, respectivamente). O alimento infantil é o CRM que fornece valores para o maior número de carotenoides: luteína, zeaxantina, β-criptoxantina, licopeno, α-caroteno, β-caroteno e ainda pelo retinol e palmitato de retinol. Os valores de incerteza para os carotenoides neste CRM variam entre 16 % para zeaxantina, juntamente com seus ésteres, até 40 % para a luteína livre. Considerando os elevados valores de incerteza de carotenoides nos materiais certificados disponíveis, a exatidão de métodos para quantificação destes pigmentos geralmente é validada através de análises de recuperação, embora a

porcentagem de recuperação não expresse verdadeiramente a influência da complexidade da matriz na eficiência da extração (Mercadante, 2008).

Apesar de existirem diversos protocolos descrevendo parâmetros para validação de métodos (ICH, 1996; Thompson et al., 2002; Ribani et al., 2004), não há um procedimento definitivo a ser adotado. O processo de validação deve ser adequado às condições e necessidades do laboratório, características do analito e da amostra e critérios de aceitação desejáveis. Portanto, sua finalidade é comprovar que o método desenvolvido é adequado para o objetivo ao qual se propõe.