Validação de métodos analíticos

O processo analítico, desde a extração/isolamento do analito da amostra até a determinação instrumental, pode resultar em perdas do analito e/ou a inserção de contaminantes que poderão alterar a fidedignidade dos resultados obtidos. Dessa forma, a avaliação do controle e garantia de qualidade do método é considerada parte muito importante do processo analítico (EURACHEM, 1998).

Se um método existente for modificado, por exemplo, para atender aos requisitos específicos, ou um método totalmente novo for desenvolvido, o laboratório deve se assegurar de que as características de desempenho do método atendem aos requisitos para as operações analíticas pretendidas (INMETRO, 2010). Ou seja, para garantir que um novo método analítico gere informações confiáveis e interpretáveis sobre a amostra, ele deve ser submetido a uma avaliação denominada validação.

“Validação é um processo de definição de uma condição de análise, e que confirma que o método em causa, tem capacidade de desempenho consistente com o que a aplicação requer.” EURACHEM, 1998 “A validação deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados.” ANVISA, 2003

Apesar de muitas definições e embora não haja harmonização sobre quais parâmetros devem ser incluídos em um processo de validação de um método analítico, é consenso que um método dever ser validado segundo os objetivos do estudo em que está inserido, de forma que se obtenham resultados confiáveis e interpretáveis (LANÇAS, 2004).

Segundo Ribani e colaboradores (2004), alguns desses parâmetros de confiabilidade são baseados em critérios estabelecidos pela ANVISA (Agência Nacional

de Vigilância Sanitária), INMETRO (Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial), IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) e EURACHEM. Para análise de microcontaminantes em matrizes complexas, como as ambientais, os critérios de validação passam pela exatidão (ou recuperação), precisão (desvio padrão relativo), linearidade, sensibilidade, especificidade, seletividade, robustez, avaliação do efeito matriz, limite de detecção e limite de quantificação.

A exatidão do método é normalmente estimada pelo uso de materiais de referência certificados (CRM) ou por estudos de recuperação, utilizados muitas vezes porque para certas aplicações, os CRM não existem ou ainda porque em alguns compartimentos ambientais amostras limpas são improváveis (CANTARERO et al., 2011). Nesses casos, a exatidão (em termos de recuperação) e precisão intermediária (porcentagem do desvio padrão relativo) podem ser utilizadas como parâmetros de avaliação do desempenho (BRIX et al., 2010).

O documento da IUPAC (THOMPSON et. al., 1999) estabelece o uso desses estudos de recuperação como componente essencial da validação de todos os métodos analíticos. Para o estudo de exatidão do método, a fortificação da amostra é o procedimento menos dispendioso e comumente aplicado para estimar, em ensaios independentes, a recuperação do analito adicionado.

Em geral, os intervalos aceitáveis de recuperação para análise de resíduos estão entre 70 e 120%, com precisão de até 20%. Porém, dependendo da complexidade analítica e da amostra, este valor pode ser de 50 a 120%, com precisão de até 15% (COMISSION..., 2002; BRITO et al., 2003). Além disso, na maioria dos casos, a variabilidade dos resultados é maior com a diminuição da concentração e a recuperação pode ser diferente em altas e baixas concentrações. Dessa forma, recomenda-se que a recuperação seja avaliada em três níveis de concentração (BRITO et al., 2003; RIBANI et al., 2004).

Comumente calcula-se a exatidão do método (avaliada pela recuperação) comparando-se as áreas dos picos de cada composto extraído nos ensaios com a amostra adicionada dos analitos, com aquela obtida da solução padrão preparada no extrato da matriz (extrato de uma amostra isenta dos analitos, ou com a menor

concentração presumida dos mesmos), de forma a minimizar os erros por excesso ou redução gerados pelo efeito matriz, que podem ser bastante acentuados em matrizes complexas, como as ambientais. Esse efeito pode ser atribuído a susbtâncias co- extraídas que podem interferir, basicamente, de duas maneiras: 1) co-eluindo com os analitos de interesse durante a análise cromatográfica (efeito matriz esfecífico); 2) interferindo no processo cromatográfico de modo a aumentar ou reduzir a resposta do detector (efeito matriz inespecifico). Sendo assim, este parâmetro de desempenho analítico também deve ser cuidadosamente avaliado, pois permite verificar se os componentes da matriz afetam a resposta analítica de alguma maneira (PINHO, 2009) e, de acordo com Thompson e colaboradores (2002), pode muitas vezes ser a principal fonte de erro conhecida em medições analíticas.

O efeito matriz é usualmente avaliado quando são utilizadas técnicas de análise por cromatografia gasosa (GC) e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) hifenizada com espectrometria de massas (MS) (FAN et al, 2011; CIMINIELLO et al, 2011). Para maior confiabilidade analítica este efeito deve ser avaliado sempre, qualquer que seja a técnica cromatográfica empregada. No entanto, na literatura este tipo de abordagem tem sido pouco relatada embora eliminar este efeito seja crítico no estabelecimento de métodos confiáveis.

Outro aspecto fundamental que tem de ser examinado na validação de um método analítico são os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ). O limite de detecção é a quantidade mínima de analito detectável na amostra, porém não necessariamente quantificada como um valor exato. O limite de quantificação corresponde a menor quantidade de uma analito que pode ser quantificada com exatidão e com uma fidelidade determinada (LANÇAS, 2004). Estão disponíveis na literatura em documentos nacionais e internacionais diversas maneiras para o cálculo destes limites e, cabe ao analista estabelecer os critérios de escolha a partir de avaliação de suas especificidades, tais como complexidade da amostra, efeito induzido pela matriz e grau de confiabilidade estatística necessária.

Outro parâmetro importante da validação analítica é a determinação da linearidade, que corresponde à capacidade do método em fornecer resultados

diretamente proporcionais à concentração da substância em exame, dentro de uma determinada faixa linear de aplicação. A curva analítica é o método de quantificação mais frequentemente utilizado e geralmente envolve um intervalo mais restrito da faixa linear (RIBANI et al., 2004; LANÇAS, 2004).

Finalmente, a robustez é a medida da capacidade de um método não sofrer alterações decorrentes de pequenas variações, deliberadamente introduzidas nos parâmetros do método (LANÇAS, 2004).