Validação de Métodos Cromatográficos

Validação é uma avaliação do método utilizada a fim de se garantir que os resultados obtidos tenham confiabilidade.

A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA, 2003) define: “A validação deve garantir, através de estudos experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados”.

No Brasil a ANVISA e o Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial (INMETRO, 2003) disponibilizam guias para o procedimento de validação de métodos analíticos, respectivamente, a Resolução ANVISA RE nº 899, de 29/05/2003 e o documento INMETRO DOQ-CGCRE-008, de março/2003.

O processo de validação consiste na avaliação de diferentes parâmetros, a saber: seletividade, linearidade e faixa de aplicação, precisão, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação e robustez.

A seguir são descritas as definições de acordo com Ribani et al. (2004).

Seletividade: é a capacidade de avaliar substâncias em exame na presença de

componentes que podem interferir com a sua determinação em uma amostra complexa. A seletividade avalia o grau de interferência de espécies como outro ingrediente ativo, excipientes, impurezas e produtos de degradação, bem como outros compostos de propriedades similares que possam estar, porventura, presentes. A seletividade garante que o pico de resposta seja exclusivamente do composto de interesse. Se a seletividade não for assegurada, a linearidade, a exatidão e a precisão estarão seriamente comprometidas.

Ela pode ser avaliada através da comparação da matriz isenta da substância de interesse e a matriz adicionada com a substância padrão, sendo que neste caso, nenhum interferente deve eluir no tempo de retenção da substância de interesse, que deve ser bem separada dos demais compostos presentes na amostra.

Linearidade e faixa de aplicação: A linearidade corresponde à capacidade do

método em fornecer resultados diretamente proporcionais à concentração da substância em exame, dentro de uma determinada faixa de aplicação.

A relação matemática entre o sinal e a concentração ou massa da espécie de interesse deve ser determinada empiricamente, a partir de sinais medidos para massas ou concentrações conhecidas da espécie. Essa relação pode ser expressa como uma equação de reta chamada curva analítica. A estimativa dos coeficientes de uma curva analítica a partir de um conjunto de medições experimentais pode ser efetuado usando o método matemático conhecido como regressão linear obtendo assim os coeficientes de regressão a e b, como também calcular o coeficiente de correlação r, que permite estimar a qualidade da curva obtida, pois quando mais próximo de 1,0, menor a dispersão do conjunto de pontos experimentais.

A faixa de aplicação corresponde ao intervalo entre o valor superior e o inferior da substância em exame que atenda aos requisitos de precisão e exatidão.

Precisão: representa a dispersão dos resultados de ensaios repetidos para mesma

amostra ou padrão.

A precisão pode ser expressa pelo: 1 Desvio-padrão absoluto (Equação 5):

(5) Onde: é a média aritmética de um pequeno número de medições;

é o valor individual de uma medição e n é o número de medições.

2 Desvio padrão relativo (coeficiente de variação, CV) (Equação 6):

(6)

3 Intervalo de confiança da média (IC) (Equação 7):

IC

(7)

Onde: é o valor crítico da distribuição de Student com n-1 graus de liberdade. O valor t é Tabelado e apresenta valores para diferentes níveis de confiança.

A precisão pode ser expressa em três níveis diferentes: repetitividade, precisão intermediária e reprodutibilidade. A repetitividade representa a reprodução dos resultados de medições sucessivas efetuadas num curto espaço de tempo e sob as mesmas condições: mesmo procedimento, mesmo analista, mesmo instrumento e mesmo local. A precisão intermediária indica a variação referente a alterações dentro do mesmo laboratório: dias diferentes, analistas diferentes ou equipamentos diferentes. A reprodutibilidade é o resultado de estudos de colaboração em que vários laboratórios analisam uma amostra em comum. Ela é importante para a padronização de procedimentos analíticos a serem incluídos no Codex Alimentarius ou em farmacopéias.

Exatidão: Representa o grau de concordância entre os resultados individuais

encontrados em um determinado ensaio e um valor de referência aceito como verdadeiro. Os processos mais utilizados para avaliar a exatidão de um método são, materiais de referência certificados (CRM), que podem ser adquiridos em órgãos reconhecidos, como o NIST (National Institute of Standards and Technology – USA), e são acompanhados de um certificado que possui o valor e a incerteza para a concentração de uma dada substância ou outra grandeza para cada parâmetro e uma incerteza associada. Outra forma de avaliação da exatidão é pela comparação dos resultados obtidos empregando-se o método em desenvolvimento e os resultados conseguidos através de um método de referência, avaliando o grau de proximidade entre os resultados obtidos pelos dois métodos, ou seja, o grau de exatidão do método testado em relação ao de referência.

Outra avaliação são os ensaios de recuperação, definido como a quantidade de substância presente ou adicionado ao material de teste, que é extraída e passível de ser quantificada. Ela deve ser avaliada adicionando-se a substância de interesse à matriz em estudo, em, pelo menos, três concentrações.

Método de adição de padrão também é outra ferramenta. No método de adição padrão, quantidades conhecidas da substância são adicionadas em diferentes níveis numa matriz da amostra, antes do procedimento de preparo da amostra, que já contenha quantidades (desconhecidas) da substância. A concentração da substância de interesse na amostra original pode ser determinada gráfica e matematicamente.

Limite de detecção: (LD) representa a menor concentração da substância que pode

ser detectada, mas não necessariamente quantificada. O LD pode ser calculado de três maneiras:

Método visual: É utilizado para determinar o limite de detecção utilizando a matriz com adição de concentrações conhecidas da substância de interesse, de tal modo que se possa distinguir entre ruído e sinal analítico pela visualização da menor concentração visível (detectável).

Método da relação sinal-ruído: Comparação entre a medição dos sinais de amostras em baixas concentrações conhecidas do composto de interesse na matriz e um branco (matriz isenta do composto de interesse) destas amostras. Assim, é estabelecida uma concentração mínima na qual a substância pode ser facilmente detectada. A relação sinal- ruído pode ser de 3:1 ou 2:1, proporções geralmente aceitas como estimativas do limite de detecção.

Método baseado em parâmetros da curva analítica: Podendo ser expresso como (Equação 8):

(8) Onde: s é a estimativa do desvio padrão da resposta, que pode ser a estimativa do desvio padrão do branco, da equação da linha de regressão ou do coeficiente linear da equação.

Limite de quantificação: (LQ) representa a menor concentração da substância que

pode ser quantificada.

Os mesmos critérios de LD podem ser adotados para o LQ, utilizando a relação 10:1, ou seja, o LQ pode ser calculado utilizando o método visual, a relação sinal-ruído ou a relação entre a estimativa do desvio padrão da resposta (s) (que pode ser a estimativa do desvio padrão do branco, da equação da linha de regressão ou do coeficiente linear da equação) e a inclinação da curva analítica (S), em níveis próximos ao LQ, a partir da equação (Equação 9):

(9)

Robustez: mede a sensibilidade de um método frente a pequenas variações, como o

pH e a força iônica da fase móvel, programação de temperatura, tempo de extração, etc. Neste trabalho serão apresentado os resultados obtidos para a validação da metodologia que será utilizada para a análise dos compostos de interesse e as próximas etapas que serão realizadas para a provável detecção e determinação dos analitos.