Validação do método

Para a validação do método proposto foram avaliadas as seguintes figuras de mérito: limite de detecção (LD) e quantificação (LQ); linearidade; efeito de matriz; exatidão, precisão e robustez.

3.12.1 Limite de detecção e quantificação

O LD é definido como a concentração mínima do analito que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada. Já o LQ é a concentração mínima que pode ser quantificada com exatidão e precisão aceitáveis. O LD foi determinado pelo cálculo da razão sinal ruído, o qual considera como LD a concentração equivalente a 3 vezes a razão entre a altura do pico cromatográfico e a altura do ruído instrumental. Da mesma forma, o LQ foi estabelecido como a concentração equivalente a 10 vezes a razão sinal ruído.102 _{As adições dos analitos foram feitas em solução}

aquosa.

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98 _{Rodrigues, M. I.; Iemma, A. F.; Planejamento de experimentos e otimização de processos: uma estratégia sequencial de} planejamentos. Cárita editora, 2005.

101 _{Anschau et al.; J. Braz. Chem. Soc. 22 (2011) 2148-2156.} 102 _{Ribani et al.; Quim. Nova 27 (2004) 771-780.}

3.12.2 Linearidade

A linearidade é a capacidade de uma metodologia analítica de demonstrar que os resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo especificado.103 _{Para avaliar a linearidade, foi feita uma}

curva de calibração no solvente em uma faixa de 0,05 a 1,25 mg L-1 _{e 0,08 a 0,4 mg L}-1

para as espécies CH3Hg+ e Hg2+, respectivamente. Cabe salientar, que cada ponto foi

avaliado em triplicata e as faixas de concentração estudadas foram escolhidas com base em uma revisão na literatura e de acordo com as concentrações de mercúrio encontradas em amostras de peixe. Da mesma forma, foram feitas curvas de adição de analito nas mesmas faixas de concentração, onde os analitos foram adicionados na matriz antes da extração por MSPD.

A validade das curvas analíticas estudadas foi avaliada através do método da regressão linear, onde foi possível estimar os coeficientes de determinação (r2_{). Estes}

parâmetros representam o grau de ajuste dos dados experimentais à curva analítica, pois quanto mais próximo da unidade, menor é a dispersão dos dados e menor é a

incerteza dos coeficientes de regressão estimados.104

3.12.3 Efeito de matriz

O efeito de matriz pode ser definido como a influência de um ou mais componentes da matriz na medida da concentração ou massa do analito. A existência de efeito de matriz pode ser verificada através da comparação da resposta analítica dos padrões preparados no solvente e na matriz.105 _{Desta forma, foram preparadas}

curvas analíticas no solvente e na matriz com concentrações de 0,05 a 1,0 mg L-1 _e

0,08 a 0,4 mg L-1_{, expresso como Hg, para as espécies CH}

3Hg+ e Hg2+,

respectivamente. A curva analítica preparada no solvente foi feita através de adições dos analitos em solução aquosa, seguida de derivatização. A curva analítica preparada na matriz foi feita da mesma forma, porém as adições dos analitos foram feitas nos extratos provenientes do procedimento de MSPD. Além disso, para fins de

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103 _{INMETRO, Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia. Orientação sobre validação de métodos de ensaios} químicos, DOQ-CGCRE-008, 2007.

104 _{Chui et al.; Quim. Nova 24 (2001) 374-380.}

105 _{SANCO, Method validation and quality control procedures for pesticide residues analysis in food and feed, Documento} Nº 10684, 2010.

comparação, as curvas foram feitas no mesmo dia para minimizar a variação que é observada quando as medições são feitas em dias diferentes.

O efeito de matriz pode ser calculado através da relação entre as inclinações

das curvas analíticas preparadas na matriz e no solvente, conforme equação (7).106

      − × = S m S S 1 100 C (7)

onde C representa o efeito de matriz (%); SS é a inclinação (coeficiente angular)

da curva de calibração preparada no solvente e Sm é a inclinação da curva de

calibração preparada na matriz. Economou et al.,106 _{classificaram o efeito de matriz nas}

seguintes faixas: baixo (-20% < C < 20%); médio (-50% < C < -20% ou 20% > C > 50%) e alto (C < -50% ou C > 50%).

3.12.4 Exatidão e precisão

Exatidão representa o grau de concordância entre os resultados individuais encontrados em um determinado ensaio e um valor de referência aceito como verdadeiro. A precisão é um termo geral utilizado para avaliar a dispersão de resultados entre ensaios independentes, repetidos de uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões, em condições definidas.103

A exatidão e precisão do método foram avaliadas através da aplicação do método proposto em materiais de referência de fígado de peixe (DOLT-3) e músculo de peixe (DORM-2), onde foram feitos ensaios em triplicata, com 3 injeções no GC-MS para cada replicata. A exatidão foi avaliada de acordo com a concordância entre os valores observados pelo método proposto e os valores certificados pelo CRM. A precisão foi avaliada utilizando como critério o RSD entre as medidas. Em métodos empregados para análise de traços ou impurezas por técnicas cromatográficas, podem ser aceitos valores de RSD de até 20%, dependendo da complexidade da amostra.102

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102 _{Ribani et al.; Quim. Nova 27 (2004) 771-780.}

103 _{INMETRO, Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia. Orientações sobre validação de métodos de} ensaios químicos, DOQ-CGCRE-008, 2007.

3.12.5 Robustez

A robustez de um método mede a sensibilidade que este apresenta a pequenas variações, ou seja, quando um método não é afetado por uma modificação pequena e deliberada em seus parâmetros, pode-se dizer que este método é robusto.103

A robustez do método foi avaliada variando o tempo de agitação em vórtex durante a extração das espécies de mercúrio com a solução de NaCl em HCl. Esta avaliação fez parte do planejamento fatorial completo 23_{, o qual teve a variável tempo}

de agitação (tA) em vórtex adicionada à estratégia de planejamentos fatoriais

sequenciais, sendo possível avaliar o tA de 1 a 15 min e observar o efeito desta variável

na recuperação das espécies de mercúrio.

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103 _{INMETRO, Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia. Orientações sobre validação de métodos de} ensaios químicos, DOQ-CGCRE-008, 2007.