Validação do método microbiológico 1 Linearidade

A curva analítica final foi construída a partir da média de quatro curvas analisadas em quatro dias diferentes, cada uma composta pela média dos halos de seis placas, conforme descrito na seção 5.1.5.1. Os dados obtidos na construção da curva analítica foram analisados para obtenção da equação da reta através da regressão linear, pelo método dos mínimos quadrados e a verificação da linearidade e do paralelismo foi constatada pela análise de variância (ANOVA). Também foram avaliados os coeficientes de correlação.

5.1.6.2. Precisão

Foi avaliada por meio da repetibilidade e precisão intermediária.

Para o ensaio de repetibilidade (intradia), seis placas com três doses de solução padrão (P) e amostra (A) foram preparadas e os dados obtidos no mesmo dia, sob as mesmas condições experimentais, laboratório e analista, foram analisados quanto ao coeficiente de variação (CV%) para cada dose utilizada.

A precisão intermediária foi avaliada por meio do cálculo do coeficiente de variação percentual (CV%) obtido na análise de seis réplicas da solução padrão (P2) obtidos em três

dias consecutivos.

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5.1.6.3. Exatidão

Foi determinada pelo ensaio de recuperação, utilizando o método de adição de padrão. O teste de recuperação foi realizado adicionando três níveis de concentração, 80 (R1), 100 (R2) e 120% (R3) de solução padrão às amostras. O ensaio foi realizado em

triplicata nas concentrações de 2,4; 3,0 e 3,6 ȝg/mL, sendo que, estas soluções foram adicionadas no lugar de A1, A2 e A3, respectivamente. A porcentagem de recuperação foi

calculada para cada nível de concentração. Desta maneira, é possível avaliar a exatidão do método em determinar a potência de amostras com concentrações pré-determinadas. As amostras foram preparadas de acordo com a Tabela 5.3.

Tabela 5.3. Preparo das soluções para o teste de recuperação no ensaio microbiológico de

flucloxacilina sódica pelo método de difusão em ágar

volume de solução amostra (100 μg/mL) (μL) volume de solução FLU-SQR adicionada (100 μg/mL) (μL) concentração teórica final (μg/mL)* Amostra 200 - 2,0 R1 200 40 2,4 R2 200 100 3,0 R3 200 160 3,6 SQR - 200 2,0

*cada nível de concentração foi preparado em triplicata em balão volumétrico de 10 mL. 5.1.6.3.1. Cálculo do teste de recuperação

A porcentagem de FLU sódica recuperada foi calculada pela equação da reta para encontrar a concentração de cada nível (R1, R2 e R3), seguido pela Equação 2 (AOAC,

2002) para calcular a porcentagem de recuperação.

(%

)=

[(C

−

C

)

C

]×100

R

Em que: Cr = concentração da solução amostra adicionada de SQR (μg/mL)

Ca= concentração da solução amostra

Cp = concentração teórica da solução SQR adicionada (μg/mL)

5.1.6.4. Robustez

Foi avaliada por meio de modificações nas condições experimentais estabelecidas, tais como: tempo de incubação (17 e 19 horas) e volume da camada semeada (4,5 e 5,5

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mL). As respostas obtidas com a solução padrão (P2) nas diferentes condições foram

analisadas estatisticamente utilizando o teste t de Student para avaliar a interferência das modificações.

5.1.6.5. Especificidade/ Seletividade

A especificidade foi avaliada por meio das soluções placebo. As amostras foram preparadas com o excipiente presente nas cápsulas de acordo com a seção 5.1.4.3. Foi verificado se houve formação de halo de inibição de crescimento do micro-organismo quando estas soluções foram utilizadas para o preenchimento dos orifícios dos templates.

A seletividade foi comprovada pelo teste de análise de variância realizada para os valores da inclinação da reta das curvas analíticas obtidas com a solução de FLU-SQR e FLU-cápsula, durante três dias consecutivos (BRUCE et al., 1998).

5.1.7. Resultados

Os halos de inibição obtidos estão apresentados na Figura 5.2. Os valores dos diâmetros dos halos de inibição do crescimento bacteriano, obtidos para as soluções de diferentes concentrações de FLU-SQR e amostras estão apresentados na Tabela 5.4.

Figura 5.2. Halos de inibição obtidos no doseamento microbiológico da flucloxacilina sódica utilizando

o delineamento 3 x 3, em que P1 (1,5 μg/mL), P2 (3,0 μg/mL), P3 (6,0 μg/mL) e A1 (1,5 μg/mL), A2 (3,0

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Tabela 5.4. Valores dos diâmetros dos halos de inibição de crescimento obtidos no ensaio

microbiológico de flucloxacilina sódica pelo método de difusão em ágar

Concentração (μg/mL)

Diâmetro dos halos de inibição (mm)* Diâmetro médio (mm) CV (%)** P1 1,5 21,72 – 21,83 21,83 – 21,56 21,74 0,59 P2 3,0 25,92 – 25,84 26,04 – 25,45 25,81 0,99 P3 6,0 29,79 – 29,60 29,78 – 29,20 29,59 0,93 A1 1,5 21,57 – 21,32 21,66 – 21,13 21,42 1,12 A2 3,0 25,50 – 25,66 25,77 – 25,07 25,50 1,21 A3 6,0 29,24 – 29,41 29,58 – 29,96 29,55 1,04

*cada valor é a média de seis determinações realizadas em um mesmo dia, durante quatro dias; **CV (%) = coeficiente de variação percentual.

As curvas analíticas de FLU-SQR e amostra (Figura 5.3) foram construídas com as médias dos valores dos diâmetros dos halos de inibição de crescimento bacteriano de quatro curvas analíticas obtidas durante os ensaios de linearidade e paralelismo. As equações da reta, determinadas através da regressão linear, pelo método dos mínimos quadrados são: y = 5,668Ln(x) + 19,486, com coeficiente de correlação (r) igual a 0,9997, para FLU-SQR e y = 5,8628Ln(x) + 19,048, com coeficiente de correlação (r) igual a 0,9999, para FLU-cápsulas.

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Figura 5.3. Representação gráfica das curvas analíticas de soluções de FLU-SQR e FLU-cápsula, em

concentrações de 1,5; 3,0; 6,0 μg/mL, no ensaio microbiológico pelo método de difusão em ágar. 5.1.7.1. Validação

5.1.7.1.1. Linearidade

A validação da metodologia foi realizada pela ANOVA, segundo tratamento estatístico preconizado pela Farmacopeia Brasileira 5ª edição (FB 5, 2010) para ensaio 3 x 3 (Tabela 5.5). Também foi avaliada por meio dos coeficientes de correlação obtidos.

Tabela 5.5. Análise de variância dos valores dos halos de inibição obtidos no ensaio

microbiológico com a solução de flucloxacilina sódica, método de difusão em ágar

Fontes de variação GL SG QM F calc F tab

Preparação 1 0,302 0,302 5,861* 4,54 Regressão 1 255,520 255,520 4966,835* 4,54 Desvio de paralelismo 1 0,07290 0,07290 1,4170 4,54 Quadrático 1 0,03630 0,03630 0,706 4,54 Diferença de quadrático 1 0,02341 0,02341 0,455 4,54 Desvio de linearidade 2 0,060 0,030 0,580 3,68 Entre doses 5 255,954 51,191 995,055* 2,9 Entre placas 5 0,44325 0,14775 2,872 2,9 Dentro (erro) 15 0,77168 0,05145 ... ... Total 23 257,17 ... ... ...

*significativo para p<0,05; GL = graus de liberdade.

De acordo com a Farmacopeia Brasileira 5ª edição (FB 5, 2010) para validade delineamento de retas paralelas devem ser cumpridos os parâmetros de:

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9 Regressão linear: deve ser significativa, pois indica que a inclinação da reta dose- resposta é satisfatória.

9 Termos quadráticos (quadrático e diferença de quadrático): deve ser não siginificativo, pois satisfaz a linearidade.

9 Paralelismo: deve ser não significativo, pois indicam que as retas da SQR e amostra são paralelas.

9 Preparação: quando significativa, não invalida o ensaio, mas a potência estimada pode ser utilizada como potência suposta em ensaios futuros.

5.1.7.1.2. Precisão

A repetibilidade forneceu CV% inferior a 1,63%. A precisão interdias forneceu CV% de 1,30%.

5.1.7.1.3. Exatidão

A Tabela 5.6 apresenta os valores experimentais obtidos no teste de recuperação do ensaio microbiológico de FLU sódica.

Tabela 5.6. Teste de recuperação do ensaio microbiológico, pelo método de difusão em

ágar, para análise de flucloxacilina sódica

FLU-SQR