Validação do Modelo de HAP Induzido pela Monocrotalina

1.1 Avaliação clínica do modelo de HAP induzido pela monocrotalina

Numa primeira fase validamos o modelo de HAP induzido pela monocrotalina, que é o modelo experimental mais usado para estudar esta patologia em ratazanas (Umar et al., 2010). Como se pode ver na Figura 3, a partir dos sete dias após a injeção de monocrotalina, os pesos corporais dos animais do grupo MCT (n=48) foram significativamente inferiores aos do grupo CTRL (n=28) (P<0,05) (Figura 3). Ao dia 21 após a administração de monocrotalina/veículo, os animais MCT (n=48) tiveram um ganho de peso inferior ao dos animais CTRL (n=28), traduzindo-se nos seguintes pesos corporais: 262,2±2,2 g vs. 299,1±3,5 g, respetivamente (P<0,05) (Figura 3). Verificou-se a perda de peso corporal dos animais MCT, apesar destes terem sido integrados no estudo numa fase exponencial de crescimento e desenvolvimento (com cerca de 7 semanas de idade) (Charles River, 2014) e com pesos semelhantes aos do grupo CTRL (CTRL vs. MCT: 190,5±2,2 e 187,6±1,4 g; P>0,05).

Nenhum animal CTRL morreu durante o protocolo experimental, no entanto as ratazanas injetadas com MCT desenvolveram progressivamente sinais clínicos de insuficiência cardíaca descompensada, nomeadamente comportamento letárgico, dispneia com taquipneia, emagrecimento, derrame pleural e ascite. Nestes animais o limite crítico (i.e. presença de sinais de insuficiência cardíaca direita, traduzida numa pontuação global mínima de 5 obtida com a tabela de supervisão - ver Material e Métodos) que determinou a eutanásia dos animais foi atingido entre a terceira e a quarta semana após a injeção de monocrotalina.

Figura 3 – Evolução do ganho ponderal em animais dos grupos avaliados (CTRL e MCT) ao longo do protocolo experimental. Encontram-se representados os pesos registados no dia da injeção de veículo (CTRL) ou monocrotalina (MCT), designado por dia 0, e os pesos relativos aos dias 7, 14 e 21 após a indução do modelo. Os valores são apresentados como média ± EPM. *P<0,05 quando comparados com os valores dos pesos dos animais CTRL.

1.2 Disfunção ventricular direita e remodelação cardíaca e pulmonar nos animais do grupo MCT

Os parâmetros obtidos no estudo hemodinâmico cardíaco encontram-se sumariados na tabela 5. O débito cardíaco diminuiu de forma significativa nos animais MCT (33,47±1,9 mL/min) comparativamente com os animais CTRL (43,14±2,8 mL/min), sem que tenham ocorrido alterações significativas da frequência cardíaca entre os dois grupos de animais. O aumento da pós-carga do VD esperado nos animais do grupo MCT conduziu à elevação da pressão sistólica (MCT vs. CTRL: 38,20±1,9 vs 24,19±1,4 mmHg; P<0,05). O dP/dtmax, outro

parâmetro de função sistólica que avalia a velocidade máxima de elevação da pressão intraventricular, também aumentou nos animais MCT (MCT vs CTRL: 1680±88,4 vs 2099±69,5 mmHg/s; P<0,05).

Relativamente aos parâmetros de função diastólica, o dP/dtmin, que traduz a velocidade

máxima de queda da pressão intraventricular, aumentou nos animais MCT (MCT vs. CTRL: 1997±70,6 vs 1400±65,5 mmHg/s; P<0,05). Contrariamente, a pressão telediastólica do VD não foi diferente entre os dois grupos de animais, embora se tenha constatado uma tendência para a sua elevação nos animais doentes. Também não se observaram diferenças na velocidade de relaxamento determinada pela constante de tempo τ.

0 7 14 21 0 150 200 240 280 Dia do protocolo Peso corporal (g) CTRL (n=28) MCT (n=48) * * *

Tabela 5 - Parâmetros basais recolhidos durante a avaliação hemodinâmica do VD dos animais CTRL (n=11) e MCT (n=19). Os resultados estão representados como média ± EPM. *P<0,05 vs. CTRL

CTRL (n=11) MCT (n=19)

Débito cardíaco (mL/min) 43,1±2,8 33,5±1,9*

Frequência cardíaca (bpm) 384,8±8,9 377,9±8,4 VD Pressão sistólica (mmHg) 24,2±1,4 38,2±1,9* Pressão telediastólica (mmHg) 3,8±1,1 4,6±0,5 dP/dtmax (mmHg/s) 1680±88,4 2099±69,5* dP/dtmin (mmHg/s) 1400±65,5 1997±70,6* τ (ms) 13,4±1,3 12,1±0,6

Os tecidos dos animais em estudo foram sujeitos a avaliação morfométrica depois do dia 21 (entre a 3ª e 4ª semana), sendo que nesta fase a quase totalidade dos índices avaliados sofreram alterações nos animais do grupo MCT, quando comparados com o grupo CTRL (Tabela 6). Relativamente ao peso do coração normalizado para o peso corporal, verificou-se que no grupo MCT o coração apresentava um peso superior ao grupo CTRL (4,81±0,10 vs. 3,83±0,08 mg/g). Uma vez que o peso corporal pode ser afetado pela exposição à monocrotalina (ex. edemas, perda de massa gorda, etc.), este parâmetro não seria a melhor medida de normalização. Assim, os pesos do VD e do pulmão foram normalizados para o comprimento da tíbia (Steffen et al., 2008). Foi possível observar no grupo MCT que tanto o peso do pulmão (MCT vs. CTRL: 626,93±17,27 vs. 444,69±16,43 mg/cm; P<0,01), como do VD (MCT vs. CTRL: 83,47±3,0 vs. 57,70±2,3 mg/cm; P<0,01) aumentaram, traduzindo a presença de congestão pulmonar e hipertrofia ventricular direita, respetivamente. A hipertrofia do VD foi também confirmada através da análise do índice de Fulton que avalia a razão entre a massa do VD e do VE+septo. Verificou-se um aumento do índice de Fulton nos animais MCT devido à sobrecarga de pressão (MCT vs. CTRL: 0,43±0,01 vs. 0,29±0,01 mg/mg; P<0,01). O índice de Fulton é um marcador importante da hipertrofia VD que se encontra aumentado na HAP (Izikki et al., 2013; Chaumais et al., 2014; Sadamura-Takenaka et al., 2014).

Tabela 6 - Peso corporal e dos órgãos dos animais CTRL e MCT. Os resultados estão representados como média ± EPM. *P<0,01 vs. CTRL. VD, ventrículo direito; VE, ventrículo esquerdo.

CTRL(n=28) MCT(n=46)

Peso corporal (g) 299,1±3,5 262,2±2,2*

Peso coração (mg) 1148,9±30,5 1260,1±24,96*

Peso VD (mg) 203,9±7,8 291,5±10,3*

Peso VE+septo (mg) 692,7±9,2 680±11,5

Peso coração: peso corporal (mg/g) 3,8±0,1 4,8±0,1*

Peso VD: peso VE+septo (mg/mg)

(Índice de Fulton) 0,3±0,01 0,4±0,01*

Peso VD: comprimento tíbia (mg/cm) 57,7±2,3 83,5±3,0*

Peso pulmão: peso corporal (mg/g) 5,3±0,2 8,4±0,3*

Peso pulmão: comprimento tíbia (mg/cm) 444,7±16,4 626,9±17,3*

Os resultados da análise histológica do VD vieram reforçar os resultados morfométricos. A hipertrofia das fibras musculares do VD, expressa pela área de secção transversa dos cardiomiócitos, foi avaliada em preparações coradas pela HE. No grupo MCT (n=2) verificou-se um aumento da área de secção transversa dos cardiomiócitos do VD, quando comprados com o grupo CTRL (n=3) (463,39±16,72 vs. 312,57±11,39 µm2; P<0,05) (Figura 4). Assim, através da análise da área de secção transversa dos cardiomiócitos do VD, verificamos que os animais MCT apresentavam hipertrofia no tecido ventricular direito.

Figura 4 – Imagens representativas do tamanho dos cardiomiócitos no grupo CTRL (A) e MCT (B) (coloração HE; ampliação: 400x).

Na avaliação histológica do pulmão procedeu-se à medição da espessura da camada média e do diâmetro externo das artérias pulmonares, indicativo do grau de hipertrofia da artéria pulmonar. Nos animais CTRL, a espessura da camada média arterial face ao diâmetro

externo foi em média de 37±5% (n=3), enquanto nos animais MCT esta razão foi significativamente superior (57±3%, n=2) (Figura 5).

Figura 5 – Imagens representativas da espessura da camada média e do diâmetro externo das artérias pulmonares (setas) no grupo CTRL (A) e MCT (B) (coloração HE; ampliação: 400x).

2. Papel dos Recetores A1 e A2 da Adenosina sobre o Coração Isolado de Ratazana com