6. CONCLUSÃO
6.1. Validação do modelo metabólico de Streptomyces olindensis
Para verificar se o modelo era preditivo foram realizadas simulações em diferentes condições de otimização (maximização do crescimento celular e maximização da produção de cosmomicina) e de restrições (com e sem restrição das velocidades específicas de consumo de aminoácidos, carboidrato, fosfato e nitrogênio excedente). Os resultados das simulações foram comparados com os dados da literatura e a condição na qual restringe as velocidades específicas de consumo dos componentes do meio complexo (extrato de levedura e casaminoácidos) mostrou habilidade em predizer os dados experimentais da literatura em diferentes condições de otimização.
As restrições impostas para as velocidades específicas de consumo de aminoácidos, carboidrato, fosfato e nitrogênio excedente se basearam na composição do meio complexo (R5Mod). A descrição desse meio foi de extrema importância para obtenção de um modelo preditivo.
Com a simulação da condição sem restrição das velocidades específicas de consumo de aminoácidos, carboidrato, fosfato e nitrogênio excedente foram obtidos valores de fluxos muito distantes dos valores experimentais podendo ser um indicativo da máxima capacidade do micro-organismo em obter esses rendimentos. Levando a acreditar que a composição de aminoácidos no meio de cultivo é uma variável importante tanto para o crescimento celular quanto para a produção de cosmomicina por Streptomyces olindensis ICB20.
6.2. Aplicação da modelagem metabólica
Ao aplicar a modelagem metabólica para obter a distribuição dos fluxos foram obtidas interessantes conclusões em relação ao metabolismo de Streptomyces olindensis ICB20 e a produção de cosmomicina.
Ao analisar a distribuição dos fluxos, otimizando o crescimento celular, em diferentes vazões específicas de alimentação (0,03, 0,05, 0,1 h-1) foi verificado que o incremento nessa taxa induziu a uma maior disponibilidade de acetil-CoA, precursor da biossíntese de ácidos graxos. Essa variação gerou mudanças na produção de oxoglutarato, na via do glioxilato, na produção de energia, no balanço redox como também no consumo de oxigênio e na produção de CO2.
Ao analisar a distribuição dos fluxos, otimizando a produção de cosmomicina, em diferentes vazões específicas de alimentação (0,03, 0,05, 0,1 h-1) foi verificado que o consumo de glutamina, o metabolismo de piruvato e a produção de malato são variáveis importantes para a produção de cosmomicina.
Baseado no trabalho de Pamboukian (2003) foi identificado que a condição de maior produtividade em cosmomicina foi a uma vazão específica de alimentação igual a 0,05 h-1. Essa condição foi utilizada para fazer um estudo mais detalhado da distribuição dos fluxos metabólicos obtidos pelo modelo em duas condições de otimização, otimização do crescimento celular e otimização da produção de cosmomicina. Ao comparar os dois mapas de distribuição de fluxos foi verificado que houve importantes mudanças com relação a produção de energia, ao balanço redox, ao consumo de oxigênio, geração de dióxido de carbono, aos fluxos no ciclo de Krebs incluindo a via do glioxilato. A produção de acetil-CoA foi maior ao maximizar a produção de cosmomicina e o direcionamento do acetil-CoA para biossíntese de ácidos graxos foi maior ao otimizar o crescimento celular. Com esse estudo foi verificado a importância de incluir no meio de cultivo precursores do antibiótico (como o acetil-CoA) e/ou do crescimento celular (como os ácidos graxos) como objetivo de diminuir a competição por precursores em comum e assim aumentar o rendimento no processo.
Com a análise de sensibilidade das funções objetivo pode ser concluído que a biossíntese de materiais de estocagem (fosfatidato) e de alguns aminoácidos (tirosina, fenilalanina e glutamato) foram identificados como fluxos mais sensíveis para provocar mudanças tanto no crescimento celular quanto na produção de cosmomicina.
Ao identificar os precursores em comum nas vias de produção de cosmomicina e de produção de ácidos graxos foi realizado um estudo avaliando o efeito da repressão da via biossintética de ácidos graxos na produção de cosmomicina. Foi realizado uma simulação propondo uma modificação genética, regulação da expressão gênica do gene FabH. Essa regulação foi obtida através da manipulação in silico do fluxo da reação catalisada pela enzima 3-oxoacil- (ACP) sintase III. Ao reduzir a velocidade específica de conversão de acetil-CoA a AcACP em 50 % foi obtido um incremento em 60% na produção de cosmomicina.
A limitação de substrato mostrou ser um fator importante quando se quer otimizar a produção de cosmomicina. A limitação de oxigênio induziu a uma redução na produção de cosmomicina a partir de 68%. A limitação de sulfato induziu a uma redução de 50% entretanto a de fosfato não interferiu na produção de cosmomicina.
A concentração de extrato de levedura também mostrou ser uma variável importante quando o objetivo é otimizar a produção de cosmomicina. Ao utilizar o modelo metabólico proposto para simular diferentes concentrações do extrato de levedura (0,5, 5, 10, 15 e 20 g/L) foi verificado uma interferência na produção de cosmomicina. A limitação da concentração de extrato de levedura no meio de cultivo, reduzindo sua concentração de 5 g/L a 0,5 g/L, levou a uma redução da velocidade específica de produção de cosmomicina em torno de 28 %. Entretando, o aumento da concentração de extrato de levedura de 5 g/L para 10, 15 e 20 g/L levou a um incremento nas velocidades específicas de produção de cosmomicina em torno de 20, 37 e 53 %, respectivamente. Esse incremento foi induzido pela inibição da via biossintética de ácidos graxos, disponibilizando uma maior quantidade de malonil-CoA para a biossíntese de cosmomicina. A produção de ATP também foi influenciada por essa mudança no meio de cultivo, sendo maior representada pela conversão de FADH2 a FAD+. Disponibilizando uma maior quantidade de NADH para ser utilizado no metabolismo secundário de Streptomyces olindensis ICB20.
Isso leva a uma indicação que o extrato de levedura é um componente importante no meio de cultivo quando se pretende estudar a produção de cosmomicina e que o aumento de sua disponibilidade no meio é uma proposta de otimização desse processo.
Baseado nessa conclusão, obtida pela simulação do modelo metabólico em estudo, foi realizada uma parte experimental para verificar in vitro o que foi obtido in silico. Para isso foram realizados dois ensaios experimentais, em incubador rotativo, para verificar a hipótese de aumento da produção de cosmomicina ao aumentar a concentração de extrato de levedura
no meio de cultivo. O ensaio 1 foi realizado com o meio R5Mod, onde a concentração de extrato de levedura era de 5 g/L. E o ensaio 2 foi realizado com o meio R5Mod mudando apenas a concentração de extrato de levedura para 20 g/L. Ao comparar os dois ensaios foi verificado que uma mudança na composição do meio em termos de concentração de extrato de levedura induziu a um incremento em torno de 100% na velocidade específica de produção de retamicina. Isso reproduz experimentalmente, de uma forma qualitativa, o que o foi simulado pelo modelo metabolólico proposto o qual obteve um incremento em 53%. A realização de experimentos em biorreator em condições contínua de processo poderá fornecer dados quantitativos para essas comparações.
O modelo metabólico construído permitiu integrar vários tipos de informações do metabolismo de Streptomyces olindensis, tanto experimentais quanto teóricas, num único quadro, fornecendo uma representação estruturada dos dados disponíveis sobre a cepa estudada. A metodologia utilizada nesse trabalho pode servir para compilação de muitos dados disponíveis na literatura com intuito de propor rotas metabólicas e assim poder fazer um estudo mais aprofundado no metabolismo a ser estudado. A utilização de modelos metabólicos é de extrema importância quando se pretende apontar estratégias e propor modificações no metabolismo minimizando as medidas experimentais e reduzindo tempo e custo de operação.
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