VALIDAÇÃO DOS ENSAIOS

5.2.1 Vírus da Febre Amarela 17D

O VFA, cujo título foi de 5,2x106 UFP/mL, teve seu limite máximo de detecção na diluição de 10-6, que corresponde a 1 UFP. A figura 6 mostra as curvas de amplificação obtidas, em triplicata, enquanto que o Gráfico 1 mostra a curva padrão e valores de Slope (-3,767), Y-intercepto (16,196), valor de coeficiente de correlação (R2) (99,6%)e eficiência da reação (84,3%) obtidos com uso dos primers Flavi all S e Flavi all AS2, com sonda Flavi all 3.

Figura 6 - Perfil linear da absorbância emitida durante cada ciclo no protocolo da curva de

concentração decrescente para o protocolo de RT-qPCR para o vírus vacinal da Febre Amarela, utilizando-se os primers Flavi all S e Flavi all AS2, com sonda Flavi all 3. Estão incluídas 3 repetições

para as diluições do vírus, de 10-1 a 10-8. Registro de resultado de experimento interpretado pelo

software ABI StepOne v2.3.

Gráfico 1 - Curva padrão de eficiência para o protocolo de RT-qPCR para o vírus vacinal da Febre

Amarela, utilizando-se os primers Flavi all S e Flavi all AS2, com sonda Flavi all 3. Para o cálculo da mesma, foram selecionados 6 pontos com 3 triplicata. Registro de resultado de experimento

5.2.2 Vírus Ilheus

O VILH, cujo título foi de 1,7x 104 UFP/mL, teve seu limite máximo de detecção na diluição de 10-7, que corresponde a 0,01 UFP. A figura 7 mostra as curvas de amplificação obtidas, em duplicata, enquanto que o Gráfico 2 mostra a curva padrão e valores de Slope (-3,787) Y-intercepto (16,482), valor de coeficiente de correlação (R2) (98,8%) e eficiência da reação (83,7%) obtidos com uso dos primers Flavi all S e Flavi all AS2, com sonda Flavi all 3.

Figura 7 - Perfil linear da absorbância emitida durante cada ciclo no protocolo da curva de

concentração decrescente para o protocolo de RT-qPCR para o vírus Ilheus, utilizando-se os primers Flavi all S e Flavi all AS2, com sonda Flavi all 3. Estão incluídas 2 repetições para as diluições do

vírus, de 10-1 a 10-8. Registro de resultado de experimento interpretado pelo software ABI StepOne

Gráfico 2 - Curva padrão de eficiência para o protocolo de RT-qPCR para o vírus Ilheus, utilizando-se

os primers Flavi all S e Flavi all AS2, com sonda Flavi all 3. Para o cálculo da mesma, foram selecionados 6 pontos com 2 repetições. Registro de resultado de experimento interpretado pelo software ABI StepOne v2.3.

5.2.3 Vírus da Encefalite de Saint Louis

O VESL, cujo título foi de 9,4 x 104 UFP/mL, teve seu limite máximo de detecção na diluição de 10-5, que corresponde a 0,1 UFP. A figura 8 mostra as curvas de amplificação obtidas, em triplicata, enquanto que o Gráfico 3 mostra a curva padrão e valores de Slope (-3,973) Y-intercepto (23,459), valor de coeficiente de correlação (R2) (97,2%) e eficiência da reação (78,5%) obtidos com uso dos primers Flavi all S e Flavi all AS2, com sonda Flavi all 3.

Figura 8- Perfil linear da absorbância emitida durante cada ciclo no protocolo da curva de

concentração decrescente para o protocolo de RT-qPCR para o vírus da Encefalite de Saint Louis, utilizando-se os primers Flavi all S e Flavi all AS2, com sonda Flavi all. Estão incluídas 2 repetições para as diluições do vírus, de 10-1 a 10-8. Registro de resultado de experimento interpretado pelo software ABI StepOne v2.3.

Gráfico 3 - Curva padrão de eficiência para o protocolo de RT-qPCR para o vírus da Encefalite de

Saint Louis, utilizando-se os primers Flavi all S e Flavi all AS2, com sonda Flavi all. 3 Para o cálculo da mesma, foram selecionados 5 pontos com 3 repetições. Registro de resultado de experimento interpretado pelo software ABI StepOne v2.3.

5.2.4 Vírus Zika

O VZIK, cujo título foi de 7,5 x 105 UFP/mL, teve seu limite máximo de detecção na diluição de 10-6, que corresponde a 0,1 UFP. A figura 9 mostra as curvas de amplificação obtidas, em triplicata, enquanto que o Gráfico 4 mostra a curva padrão e valores de Slope (-3,558) Y-intercepto (20,863), valor de coeficiente de correlação (R2) (99,5%) e eficiência da reação (91%) obtidos com uso dos primers Flavi all S e Flavi all AS2, com sonda Flavi all 3.

Figura 9 - Perfil linear da absorbância emitida durante cada ciclo no protocolo da curva de

concentração decrescente para o protocolo de RT-qPCR para o vírus Zika, utilizando-se os primers Flavi all S e Flavi all AS2, com sonda Flavi all 3. Estão incluídas 4 repetições para as diluições do

vírus, de 10-1 a 10-8. Registro de resultado de experimento interpretado pelo software ABI StepOne

Gráfico 4 - Curva padrão de eficiência para o protocolo de RT-qPCR para o vírus Zika, utilizando-se

os primers Flavi all S e Flavi all AS2, com sonda Flavi all 3. Para o cálculo da mesma, foram selecionados 5 pontos com 3 repetições. Registro de resultado de experimento interpretado pelo software ABI StepOne v2.3.

5.2.5 Vírus Iguape

O VIGP, cujo título foi de 4,4x108 UFP/mL, teve seu limite máximo de detecção na diluição de 10-6, que corresponde a 1 UFP. A figura 10 mostra as curvas de amplificação obtidas, em triplicata, enquanto que o Gráfico 5 mostra a curva padrão e valores de Slope (-3,357) Y-intercepto (21,03), valor de coeficiente de correlação (R2)(97,2%) e eficiência da reação (98,5%) obtidos com uso dos primers Flavi all S e Flavi all AS2, com sonda Flavi all 3.

Figura 10 - Perfil linear da absorbância emitida durante cada ciclo no protocolo da curva de

concentração decrescente para o protocolo de RT-qPCR para o vírus Iguape, utilizando-se os primers Flavi all S e Flavi all AS2, com sonda Flavi all 3. Estão incluídas 3 repetições para as diluições do

vírus, de 10-1 a 10-8. Registro de resultado de experimento interpretado pelo software ABI StepOne

Gráfico 5 - Curva padrão de eficiência para o protocolo de RT-qPCR para o vírus Iguape, utilizando-

se os primers Flavi all S e Flavi all AS2, com sonda Flavi all 3. Para o cálculo da mesma, foram selecionados 5 pontos com 3 repetições. Registro de resultado de experimento interpretado pelo software ABI StepOne v2.3.

5.2.6 Vírus Cacipacore

O VCPC, cujo título foi de 3x104 UFP/mL, teve seu limite máximo de detecção na diluição de 10-7, que corresponde a 0,1 UFP. A figura 11 mostra as curvas de amplificação obtidas, em triplicata, enquanto que o Gráfico 6 mostra a curva padrão e valores de Slope (-3,581) Y-intercepto (18,056), valor de coeficiente de correlação (R2)(97,4%) e eficiência da reação (90,2%) obtidos com uso dos primers Flavi all S e Flavi all AS2, com sonda Flavi all 3.

Figura 11- Perfil linear da absorbância emitida durante cada ciclo no protocolo da curva de

concentração decrescente para o protocolo de RT-qPCR para o vírus Cacipacore, utilizando-se os primers Flavi all S e Flavi all AS2, com sonda Flavi all 3. Estão incluídas 3 repetições para as

diluições do vírus, de 10-1 a 10-8. Registro de resultado de experimento interpretado pelo software ABI

Gráfico 6 - Curva padrão de eficiência para o protocolo de RT-qPCR para o vírus Cacipacore,

utilizando-se os primers Flavi all S e Flavi all AS2, com sonda Flavi all 3. Para o cálculo da mesma, foram selecionados 6 pontos com 3 repetições. Registro de resultado de experimento interpretado pelo software ABI StepOne v2.3.

5.2.7 Vírus Bussuquara

O VBSQ, cujo título foi de 1 x 103,6 TCID50/100/µL, teve seu limite máximo de detecção na diluição de 10-2, que corresponde a 1 x 101.6 TCID50/100/µL. A figura 12 mostra as curvas de amplificação obtidas, em triplicata, obtidos com uso dos primers Flavi all S e Flavi all AS2, com sonda Flavi all 3. A curva de eficiência não pôde ser realizada para este vírus, uma vez que não foi possível selecionar pelo menos cinco pontos para sua elaboração.

Figura 12 - Perfil linear da absorbância emitida durante cada ciclo no protocolo da curva de

concentração decrescente para o protocolo de RT-qPCR para o vírus Bussuquara, utilizando-se os primers Flavi all S e Flavi all AS2, com sonda Flavi all 3. Estão incluídas 3 repetições para as

diluições do vírus, de 10-1 a 10-8. Registro de resultado de experimento interpretado pelo software ABI

StepOne v2.3.