Validação dos resultados

7.1. Identidade

A identidade do analito pode ser confirmada por co-cromatografia ou por recurso a um detector de díodos, comparando os espectros do ex­ tracto de amostra e da solução de calibração (3.9.3) que contém 6 μg/ml de robenidina.

7.1.1. C o - c r o m a t o g r a f i a

Fortificar um extracto de amostra com a adição de uma quantidade adequada de solução de calibração (3.9.3). A quantidade de robenidina adicionada deve ser idêntica à quantidade de robenidina presumida no extracto de amostra.

Apenas se deverá verificar um aumento da altura do pico correspondente à robenidina, atendendo à quantidade adicionada e à diluição do extrac­ to. A largura do pico a meia altura não poderá diferir mais de 10 % da largura inicial.

7.1.2. D e t e c ç ã o c o m u m d e t e c t o r d e d í o d o s

Os resultados são avaliados de acordo com os seguintes critérios: a) O comprimento de onda de absorção máxima dos espectros da amos­

tra e do padrão, registado no máximo do pico cromatográfico, deve ser o mesmo, com uma margem de variação dependente da resolução do sistema de detecção. No caso de um detector de díodos, esta margem é, em geral, de ± 2 nm.

b) Entre 250 e 400 nm, os espectros da amostra e do padrão, registados no máximo dos picos cromatográficos, não devem diferir entre si no que respeita às zonas do espectro que apresentem uma absorvância relativa compreendida entre 10 % e 100 %. Este critério considera-se satisfeito se estiverem presentes os mesmos máximos e a diferença entre ambos os espectros não exceder, em caso algum, 15 % da absorvância do analito-padrão;

c) Entre 250 e 400 nm, os espectros na curva ascendente, no máximo e na curva descendente do pico do extracto da amostra não diferem entre si nas partes do espectro compreendidas entre 10 % e 100 % de absorvância relativa. Este critério considera-se satisfeito se estiverem presentes os mesmos máximos e a diferença entre os espectros não exceder, em caso algum, 15 % da absorvância do espectro no máximo do pico.

Se algum destes critérios não for satisfeito, a presença do analito não pode ser confirmada.

7.2. Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectua­ das com a mesma amostra não deve exceder 10 % do maior dos valores, para teores de robenidina superiores a 15 mg/kg.

7.3. Recuperação

A taxa de recuperação de uma amostra em branco fortificada deve ser de, pelo menos, 85 %.

8. Resultados de um estudo interlaboratorial

Num estudo interlaboratorial promovido a nível comunitário, procedeu- -se à análise por 12 laboratórios de quatro amostras de alimentos para aves de capoeira e coelhos, sob a forma de farinha e granulado. Para cada amostra, foram efectuadas análises em duplicado. Os resultados obtidos foram os seguintes:

Aves de capoeira Coelhos Farinha Granulado Farinha Granulado Média [mg/kg] 27,00 27,99 43,6 40,1 s r [mg/kg] 1,46 1,26 1,44 1,66 CV r [ %] 5,4 4,5 3,3 4,1 S R [mg/kg] 4,36 3,36 4,61 3,91 CV R [ %] 16,1 12,0 10,6 9,7 Recuperação [ %] 90,0 93,3 87,2 80,2 s r = desvio-padrão da repetibilidade

CV r = coeficiente de variação da repetibilidade ( %) S R = desvio-padrão da reprodutibilidade

CV R = coeficiente de variação da reprodutibilidade ( %) (F) DETERMINAÇÃO DO DICLAZURIL

(+)-4-clorofenil[2,6-dicloro-4-(2,3,4,5-tetra-hidro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin- 2-il)fenil]-acetonitrilo

1. Objecto e âmbito de aplicação

Este método permite determinar o teor de diclazuril em alimentos para animais e pré-misturas. O limite de detecção é de 0,1 mg/kg; o limite de quantificação é de 0,5 mg/kg.

2. Princípio

Depois de adicionado um padrão interno, submete-se a amostra a uma operação de extracção com metanol acidificado. No caso dos alimentos para animais, purifica-se uma alíquota do extracto num cartucho de extracção com fase sólida C 18 , elui-se o diclazuril do cartucho com uma mistura de metanol acidificado e água, evapora-se e dissolve-se o resíduo em DMF/água. No caso das pré-misturas, evapora-se o extracto e dissolve-se o resíduo em DMF/água. O teor de diclazuril é determi­ nado por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) de fase reversa com gradiente ternário, com um detector de UV.

3. Reagentes

3.1. Água de qualidade equivalente para HPLC. 3.2. Acetato de amónio.

3.3. Hidrogenossulfato de tetrabutilamónio (TBHS). 3.4. Acetonitrilo de qualidade equivalente para HPLC. 3.5. Metanol de qualidade equivalente para HPLC. 3.6. N, N-Dimetilformamida (DMF).

3.7. Ácido clorídrico, ρ 20 = 1,19 g/ml.

3.8. Substância padrão: diclazuril II-24, (+)-4-clorofenil[2,6-dicloro-4- -(2,3,4,5-tetra-hidro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-il)fenil]-acetonitrilo de grau de pureza garantido, E 771.

3.8.1. S o l u ç ã o - m ã e p a d r ã o d e d i c l a z u r i l , 5 0 0 μ g / m l. Num balão volumétrico de 50 ml, pesar, com uma aproximação de 0,1 mg, 25 mg de diclazuril-padrão (3.8). Dissolver em DMF (3.6), com­ pletar o volume com DMF (3.6) e homogeneizar. Envolver o balão com folha de alumínio ou utilizar material de vidro ambarizado e guardar no frigorífico. A temperaturas não superiores a 4o C, a solução mantém- -se estável durante um mês.

3.8.2. S o l u ç ã o - p a d r ã o d e d i c l a z u r i l , 5 0 μ g / m l.

Transferir 5,00 ml da solução-mãe padrão (3.8.1) para um balão volu­ métrico de 50 ml, completar o volume com DMF (3.6) e homogeneizar. Envolver o balão com folha de alumínio ou utilizar material de vidro ambarizado e guardar no frigorífico. A temperaturas não superiores a 4 o C a solução mantém-se estável durante um mês.

3.9. Padrão interno: a substância utilizada é o 2,6-dicloro-α-(4-clorofenil)-4- -[4,5-di-hidro-3,5-dioxo1,2,4-triazin-2(3H)-il]-α-metilbenzenoacetonitrilo. 3.9.1. S o l u ç ã o - m ã e d e p a d r ã o i n t e r n o , 5 0 0 μ g / m l.

Num balão volumétrico de 50 ml, pesar, com uma aproximação de 0,1 mg, 25 mg de padrão interno (3.9). Dissolver em DMF (3.6), completar o volume com DMF (3.6) e homogeneizar. Envolver o balão com folha de alumínio ou utilizar material de vidro ambarizado e guardar no fri­ gorífico. A temperaturas não superiores a 4 o C, a solução mantém-se estável durante um mês.

3.9.2. S o l u ç ã o d e p a d r ã o i n t e r n o , 5 0 μ g / m l.

Transferir 5,00 ml da solução-mãe de padrão interno (3.9.1) para um balão volumétrico de 50 ml, completar o volume com DMF (3.6) e homogeneizar. Envolver o balão com folha de alumínio ou utilizar ma­ terial de vidro ambarizado e guardar no frigorífico. A temperaturas não superiores a 4 o C, a solução mantém-se estável durante um mês. 3.9.3. S o l u ç ã o d e p a d r ã o i n t e r n o p a r a a s p r é - m i s t u r a s ,

p / 1 0 0 0 m g / m l

(p = teor nominal, em mg/kg, de diclazuril na pré-mistura)

Num balão volumétrico de 100 ml, pesar, com uma aproximação de 0,1 mg, p/10 mg do padrão interno, dissolver em DMF (3.6) num banho de ultra-sons (4.6), completar o volume com DMF e homogeneizar. Envol­ ver o balão com folha de alumínio ou utilizar material de vidro amba­ rizado e guardar no frigorífico. A temperaturas não superiores a 4o C, a solução mantém-se estável durante um mês.

3.10. Solução de calibração, 2 μg/ml.

Pipetar 2,00 ml da solução-padrão de diclazuril (3.8.2) e 2,00 ml da solução de padrão interno (3.9.2) para um balão volumétrico de 50 ml. Adicionar 16 ml de DMF (3.6), completar o volume com água e homo­ geneizar. Esta solução é preparada imediatamente antes da sua utiliza­ ção.

3.11. Cartucho de extracção com fase sólida C 18 , por exemplo Bond Elut; volume: 1 cm3 , massa de substância sorvente: 100 mg.

3.12. Solvente de extracção: metanol acidificado.

Pipetar 5,0 ml de ácido clorídrico (3.7) para um recipiente com 1 000 ml de metanol (3.5) e homogeneizar.

3.13. Fase móvel para HPLC.

3.13.1. Eluente A: solução de acetato de amónio e hidrogenossulfato de tetra­ butilamónio.

Dissolver 5 g de acetato de amónio (3.2) e 3,4 g de TBHS (3.3) em 1 000 ml de água (3.1) e homogeneizar.

3.13.2. Eluente B: acetonitrilo (3.4). 3.13.3. Eluente C: metanol (3.5).

4. Equipamento