Validação do método QuEChERS modificado para análise de agrotóxicos e medicamentos veterinários em solo

Para a validação do método analítico foram utilizados os seguintes parâmetros: seletividade, efeito matriz, curva analítica e faixa de trabalho, limites de detecção (LOD) e quantificação (LOQ), precisão (repetibilidade e precisão intermediária) e exatidão (ANVISA, 2003; INMETRO, 2003; SANCO, 2010).

3.10.1 Seletividade

A avaliação da seletividade do método foi realizada através da comparação dos cromatogramas obtidos por injeções dos extratos de amostras “branco” e extratos de amostras fortificadas no sistema UHPLC-MS/MS. Esta avaliação tem por objetivo verificar a presença de interferentes no mesmo tempo de retenção dos analitos em estudo. Os solventes e reagentes também foram avaliados, através do procedimento de extração, porém sem a presença de amostra de solo.

3.10.2 Efeito matriz

Algumas considerações devem ser feitas em relação ao efeito matriz quando a espectrometria de massas for empregada como sistema de detecção em associação com a cromatografia líquida, uma vez que a matriz pode causar uma supressão da eficiência de ionização e, consequentemente, pode ocorrer uma redução na sensibilidade do método (ROGATSKI; STEIN, 2005).

Os possíveis efeitos da matriz na análise cromatográfica devem ser levados em consideração no desenvolvimento de um método analítico e, por isso foram preparadas curvas analíticas tanto em solvente, como no extrato “branco” da matriz e realizou-se a comparação das áreas obtidas para a avaliação do efeito matriz. A Equação 1 foi utilizada para a realização do cálculo do efeito matriz (GOSETTI et al., 2010; SANCO 2010).

100 % 2 2 1 _x X X X iz EfeitoMatr   (1) onde:

X1 = Média das áreas da solução analítica de cada composto avaliado, preparado no

extrato da matriz, em uma dada concentração;

X2 = Média das áreas da solução analítica de cada composto avaliado, preparada

em solvente, em uma dada concentração.

Deste modo, é possível verificar se a matriz exerce efeito positivo (aumento de sinal) ou negativo (diminuição de sinal) sobre o resultado da análise. O efeito matriz começa a exercer influência nas análises quando o resultado for acima de 20% e, então recomenda-se a construção das curvas analíticas no extrato da matriz para minimizar o efeito (GOSETTI et al., 2010; FERRER et al., 2011).

3.10.3 Curva analítica e faixa de trabalho

A curva analítica foi obtida a partir das soluções analíticas, contendo todos os agrotóxicos e medicamentos veterinários em estudo, preparadas de acordo com o item 3.6, tanto em solvente, quanto no extrato da matriz solo, nas concentrações 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; 20,0; 30,0; 40,0 e 50,0 µg L-1.

As soluções para obtenção das curvas analíticas foram injetadas em triplicata e posteriormente, realizaram-se os cálculos da média das áreas e do RSD (%). Além disso, através dos dados de regressão, obtidos com o auxílio do software (MassLynx 4.1) do equipamento, avaliou-se através do coeficiente de determinação (r2), o modelo de calibração mais adequado para ser utilizado (linear ou quadrático) e ainda foi determinada a faixa de trabalho para cada composto analisado por UHPLC- MS/MS.

3.10.4 Limite de detecção e limite de quantificação

A partir da avaliação dos dados de linearidade das curvas analíticas e dos ensaios de fortificação, de cada um dos compostos estudados, procedeu-se a determinação da estimativa do limite de detecção do instrumento (LODi) e do

método (LODm), bem como do limite de quantificação do instrumento (LOQi) e do

método (LOQm).

A determinação do LOQi foi realizada adotando-se o menor ponto da curva

analítica para cada analito, levando em consideração a relação sinal ruído (INMETRO, 2011). Para isto, foram realizadas injeções de soluções analíticas de diferentes concentrações preparadas em acetonitrila, seguida de diluição 1:4 (v/v) em água. A partir destes valores, o LODi foi determinado como sendo a

concentração 3,33 vezes menor que o LOQi. Os limites de detecção e quantificação

instrumentais foram expressos em µg L-1.

O limite de quantificação do método é considerado como sendo a menor concentração que, fortificada na matriz, apresenta resultados de recuperação entre 70 e 120%, com RSD menor ou igual a 20% (SANCO, 2011).

Para os compostos que não apresentaram resultados satisfatórios no nível de fortificação de 10 µg kg-1, preparou-se um nível de fortificação extra, na concentração de 25 µg kg-1, para ser adotado com o LOQm. Já o limite de detecção

foi determinado como sendo a concentração 3,33 vezes menor que o LOQm,

obtendo-se os valores de LODm e LOQm em µg kg-1.

3.10.5 Ensaios de fortificação e recuperação para avaliação da exatidão

Para avaliar a exatidão, o preparo da amostra foi realizado utilizando um procedimento baseado no método “QuEChERS modificado”, proposto por Prestes (2011). Sendo assim, pesou-se 10 ± 0,05 g de amostra de solo, diretamente em tubos de polipropileno com tampa rosqueável (capacidade de 50 mL), e efetuou-se a fortificação com a mistura dos pesticidas estudados, nas concentrações de 10,0; 25,0; 50,0 e 100,0 µg kg-1, adicionando para isso, respectivamente, 25,0; 50,0; 100,0 e 200,0 µL de uma solução analítica 5,0 mg L-1. Os tubos contendo o solo fortificado foram agitados por 1 min em agitador tipo vórtex e mantidos em repouso por 1 h.

Logo após, adicionou-se 10 mL de água, agitou-se por 1 min e a mistura foi mantida em repouso, por aproximadamente 10 min para hidratação das amostras.

Adicionou-se 10 mL de acetonitrila contendo 1% de ácido acético em cada tubo, e após fechá-los efetuou-se agitação em mesa agitadora por 15 minutos. Em seguida, acrescentou-se 4,0 g de sulfato de magnésio anidro e 1,7 g de acetato de sódio, e agitou-se o tubo manual e vigorosamente por 1 minuto. Após a centrifugação dos extratos a 3400 rpm durante 8 minutos, os extratos foram filtrados e diluídos em água na proporção de 1:4 (v/v) e adicionou-se 20 µL do padrão interno na concentração 1 mg L-1. Cabe ressaltar que após a adição do padrão interno, as soluções seguiram diretamente para a análise por UHPLC-MS/MS, ou seja, sem passar por nenhum procedimento de purificação, mesmo se tratando de uma matriz complexa.

Foram realizados ensaios de fortificação utilizando amostras “branco”, isto é, livre da presença dos agrotóxicos e medicamentos veterinários em estudo, para o estudo da exatidão do método, avaliando-se, assim, a recuperação dos compostos em estudo.

O procedimento de extração das amostras fortificadas foi realizado 6 vezes, para cada um dos níveis de fortificação (10,0; 25,0; 50,0 e 100,0 µg kg-1) e, cada nível foi injetado uma vez, obtendo-se 6 replicatas (n= 6, 6 extrações x 1 injeção cada).

A exatidão foi calculada com auxílio do software (MassLynx 4.1) do equipamento e é expressa em percentagem. O cálculo de recuperação foi realizado de acordo com a Equação 2, conforme recomendações do guia de validação do INMETRO (2011).

100

C

C

(%)

R







C

C1 = Concentração determinada na amostra fortificada;

C2 = Concentração determinada na amostra não fortificada;

3.10.6 Precisão (repetibilidade e precisão intermediária)

A precisão do instrumento foi avaliada através de quatro injeções, no sistema UHPLC-MS/MS, de cada concentração das soluções analíticas preparadas no extrato da matriz.

Para avaliar a precisão do método, em termos de repetibilidade (RSDr), foram

realizadas sete extrações de cada nível de fortificação e cada extrato foi injetado uma vez (n = 7).

A precisão intermediária (RSDpi) do método foi avaliada realizando o

procedimento analítico em dias diferentes, através da injeção da curva analítica e das amostras “branco” fortificadas no nível intermediário 50 µg kg-1

.

A precisão foi avaliada a partir de um valor numérico obtido da fórmula do desvio padrão relativo (RSD), conforme a Equação 3.

(3)

Onde:

s = estimativa de desvio padrão absoluto; s = {(xi – xm)2/ N - 1}1/2 ;

xi = valores individuais;

xm = média das medidas em replicatas;

N = número de medidas.