Variáveis de crescimento

No momento da coleta, selecionaram-se dez plântulas mais uniformes de cada repetição, sendo determinado os comprimentos da parte aérea (CPA) e das raízes (CR), o que foi feito com o auxílio de uma régua graduada em centímetros. Os valores foram somados e divididos pelo número de amostras (10 plântulas), resultando no comprimento médio da parte aérea e das raízes por plântula, cujos valores foram expressos em centímetros. Após essas medições, o material vegetal foi congelado a -20 ºC, liofilizado e pesado em balança de precisão com quatro casas decimais para determinação das massas secas da parte aérea (MSPA) e das raízes (MSR). Os valores dessas variáveis foram expressos em mg, sendo utilizados para o cálculo da relação entre a massa seca da parte aérea e aquela das raízes (MSPA/MSR)

O material vegetal, após liofilização e pesagem, foi macerado e o pó liofilizado armazenado a 4 oC até posterior utilização nas análises químicas e bioquímicas.

3.3 Teores de Na+ _{e K}+

Os teores de Na+ _{e K}+ _{foram determinados nas raízes e parte aérea, exceto no caso}

do genótipo CSF 20 aos 10 DAS, cujas determinações foram realizadas apenas na parte aérea, em função da pequena quantidade de material de raízes. Os extratos para a determinação dos íons foram preparados a partir da homogeneização de 100 mg do pó liofilizado da parte aérea ou das raízes com 10 mL de água desionizada, durante 1 h à 45 o_{C. Em seguida, o homogenato}

foi centrifugado a 3.000 x g a 25 o_{C por 10 min, sendo o sobrenadante coletado e filtrado em}

papel de filtro (extrato) e armazenado a -25 o_{C. Os teores de sódio e potássio foram}

determinados por fotometria de chama, segundo Malavolta, Vitti e Oliveira (1989). As determinações dos íons sódio e potássio foram realizadas em uma única leitura do extrato, e os teores foram expressos em μmol g-1 de MS.

3.4 Solutos orgânicos

3.4.1 Carboidratos solúveis

Em tubos de ensaio contendo 25 mg do pó liofilizado da parte aérea ou das raízes, foram adicionados 2,5 mL de etanol a 80%, sendo os tubos, em seguida, mantidos a 75 oC em banho-maria, durante 1 h, com agitações a cada 15 min. Decorrido esse tempo, o material foi

centrifugado a 3.000 x g, por 15 min, à temperatura ambiente (25 ºC), e o sobrenadante obtido foi coletado. A extração foi repetida mais duas vezes, partindo-se do precipitado remanescente, sob as mesmas condições já descritas, com exceção do tempo de extração, que foi reduzido para 30 min. Todos os sobrenadantes coletados foram reunidos e tiveram seu volume completado para 10 mL com etanol a 80%, em balão volumétrico, sendo em seguida armazenados a -25 oC até posterior utilização.

Os carboidratos solúveis foram determinados de acordo com Dubois et al. (1956). Em uma alíquota de 0,2 mL do extrato, convenientemente diluído com etanol a 80%, foram adicionados 0,2 mL de fenol a 5% e 1,0 mL de ácido sulfúrico concentrado. A mistura foi agitada vigorosamente e deixada em repouso para seu resfriamento. Em seguida, as amostras foram submetidas à quantificação dos carboidratos solúveis, por meio de leituras de absorbância em 490 nm, utilizando-se como branco uma mistura contendo 0,2 mL de etanol a 80% (em substituição ao extrato), 0,2 mL de fenol a 5% e 1,0 mL de ácido sulfúrico concentrado. A curva padrão foi obtida utilizando-se concentrações crescentes de D(+) glicose anidra. Os resultados de carboidratos foram expressos em µmol g-1 MS e representam a média de quatro repetições, sendo cada repetição dosada em duplicata.

3.4.2 N-aminossolúveis

Os N-aminossolúveis foram determinados de acordo com o método de Yemm e Cocking (1955), utilizando-se o mesmo extrato preparado para carboidratos solúveis. Em tubos de ensaio, foram adicionados 0,5 mL do extrato, convenientemente diluído, 0,25 mL de tampão citrato a 0,2 M (pH 5,0), 0,5 mL de cianeto de potássio a 0,2 mM, em metilcelosolve (C3H8O2)

a 100%, e 0,1 mL de ninhidrina a 5%, em metilcelosolve a 100%. Em seguida, os tubos foram fechados, agitados vigorosamente e mantidos a 95 oC, em banho-maria, durante 20 min. A reação foi interrompida abruptamente colocando-se os tubos em banho de gelo e, após resfriamento, foram adicionados 0,65 mL de etanol a 60%. Os teores de N-aminossolúveis foram estimados através de leituras de absorbância em 570 nm, tomando-se como branco todos os constituintes do meio de reação, exceto o extrato que foi substituído por igual volume de etanol a 80%. A curva padrão foi ajustada a partir de concentrações crescentes de glicina. Os resultados de N-aminossolúveis foram expressos em µmol g-1 MS e representam a média de quatro repetições, sendo cada repetição dosada em duplicata.

3.4.3 Prolina livre

A concentração de prolina livre foi determinada de acordo com Bates, Waldren e Teare (1973), sendo o extrato o mesmo descrito no item 3.2. Em uma alíquota de 0,5 mL do extrato, convenientemente diluído, foram adicionados 0,5 mL do reagente da ninhidrina ácida (1,25 g de ninhidrina, dissolvida em 30 mL de ácido acético glacial e 20 mL de ácido fosfórico a 6 M) e 0,5 mL de ácido acético glacial. Os tubos de ensaio foram hermeticamente fechados e, após homogeneização da mistura de reação, foram deixados em banho-maria fervente por 1 h. A reação foi interrompida colocando-se os tubos de ensaio em banho de gelo. Após o resfriamento, ao meio de reação, foi adicionado 1,0 mL de tolueno. Após agitação vigorosa da solução, a fase superior menos densa (cromóforo + tolueno) foi aspirada com o auxílio de uma pipeta Pasteur e submetida à leitura de absorbância em 520 nm, sendo utilizado como branco o tolueno. A concentração de prolina foi estimada com base em uma curva padrão ajustada a partir de concentrações crescentes de prolina. Os resultados de prolina foram expressos em µmol g-1 MS e representam a média de quatro repetições, sendo cada repetição dosada em duplicata.