VARIÁVEIS DO ESTUDO

As variáveis de interesse foram as características demográficas (idade e sexo), aspectos observados no início e durante o seguimento incluido: manifestações clínicas (febre, cefaléia, dor retroocular, mialgias, astenia, artralgias, sintomas gastrointestinais, respiratórios), parâmetros hematológicos e hemodinâmicos (hematócrito, contagem de plaquetas e leucocitos, pressão arterial, frequência cardíaca) e complicações (hemorragia e sinais de extravasamento plasmático).

5.6.1 Técnicas Laboratoriais

A infecção por dengue foi avaliada mediante a medição dos níveis de anticorpos da classe IgM nas amostras pareadas do soro. Para este fim, usou-se um sistema de ensaio de captura (MAC-ELISA), adaptado no laboratório de virologia da Universidade del Valle na Colômbia. Além disso, tentou-se isolamento do vírus dengue em cultivo de células de mosquito Aedes albopictus (clon C6/36) nas amostras de fase aguda, as quais permaneceram na temperatura de -70°C até o momento da incubação.

5.6.2 Instrumentos de coleta das informações

Para a coleta de dados clínicos, empregaram-se questionários padronizados os quais foram preenchidos diretamente no momento da inclusão do paciente no estudo, e durante as avaliações de seguimento (Anexo 2).

5.6.3 Criação e Manejo do Banco de Dados

O banco de dados foi criado no programa Access 2003 mediante dupla digitação. A comparação dos bancos foi realizada usando a opção

“compare” do programa Epi-Info versão 3.4 (2000); e quando houve inconsistencias entre as digitações foram consultados os questionários originais e feitas as correções. Os bancos auditados foram transferidos a arquivos compatíveis com o programa STATA, versão 9.0.

5.7 ANÁLISE

Inicialmente, foi realizada uma descrição geral dos processos de recrutamento e da população, considerando os resultados dos testes de diagnóstico. Em seguida, para alcançar os objetivos do estudo, foi feita uma análise em duas fases:

5.7.1 Classificação da Gravidade da Doença (Figura 7).

Inicialmente, foi realizada uma análise de agrupamento (ou cluster) incluindo só os pacientes com dengue confirmado por laboratório. Para esta análise foram escolhidas variáveis normalmente medidas na prática clínica e consideradas parâmetros de gravidade, incluindo a mudança do hematócrito, a menor contagem de plaquetas, a menor pressão de pulso mínimo e o sangramento. Para ter uma variável métrica da gravidade do sangramento, foi criada uma escala de 0 a 3 para localizar cada paciente em uma das seguintes opções: ausência de sangramento (0), apenas sangramento cutâneo (1), presença sangramento espontâneo em mucosas (2) e sangramento maior (3).

Todas as variáveis foram padronizadas (subtraindo a média e dividindo pelo desvio padrão) e a análise de agrupamento foi realizada utilizando um procedimento hierárquico de encadeamento médio (HAIR, 1999). Nesta análise, o critério de agrupamento é a distância média de todos os indivíduos em um cluster com outros indivíduos. A medida utilizada foi a distância euclidiana. Isto é a distância “ordinária” (que se mediria com uma

regua) entre dois pontos em um espaço cujas dimensões estão definidas pelas variáveis incluídas na análise.

Em uma primeira aproximação se identificaram os casos considerados atípicos, de acordo com o critério do investigador, mantendo o princípio de que, em conjunto, representassem menos de 5% da amostra, apresentassem um baixo grau de aglomeração e tivessem distâncias euclidianas grandes demais para chegar a os clusters principais.

Após exclusão dos atípicos, a análise cluster foi executada novamente para a eleição dos grupos, dos quais foi feita uma descrição com base nas características que os definiram. Estas variáveis foram expressas em forma categórica para facilitar a interpretação.

Posteriormente, foi feito um processo de validação para comparar os grupos segundo um conjunto de variáveis que não foram utilizadas na sua conformação, mas tem se estabelecido que elas variam segundo a gravidade da doença. Entre estas variáveis temos a hospitalização e o tempo de duração da doença (número de dias que persistiu pelo menos um sintoma).

Além disso, para a validação do cluster também se incluiu biomarcadores séricos de lesão hepática (AST e ALT) e muscular (CK) e de extravasamento de plasma (albumina). Estes marcadores não são utilizados rotineiramente para avaliar a gravidade do dengue, mas foi descrito que podem estar alterados nas formas mais graves, que cursam com elevação de AST, ALT, CK e diminuição da albumina (VILLAR-CENTENO et al., 2008).

Posteriormente, realizou-se uma adaptação dos clusters, a fim de criar grupos que possam orientar o tratamento médico e, assim, desenvolver critérios para classificar a gravidade do dengue. Com este fim, tomou-se o cluster com mais complicações, delimitou-se com base nas variáveis de gravidade e foram incluídas as complicações que normalmente exigem um tratamento especial (choque, trombocitopenia grave, etc.).

Os grupos assim formados também foram validados por comparação das variáveis de internação, duração da doença e biomarcadores. Além

disso, foi estabelecido quais doentes preenchiam a definição clássica de dengue hemorrágica da OMS (DH-OMS) e quais tinham serosite (derrame pleural ou ascite), estimando a sua frequência nos clusters e nos grupos de gravidade propostos.

5.7.2 Definição de Caso de Dengue (Figura 8).

Nesta parte da análise se fez uma descrição das manifestações do dengue e uma comparação com pacientes sem esta arboviroses. Para esse efeito, a análise incluiu todos os pacientes que tinham definido o estado de infecção por dengue, bem seja confirmada (sorológica ou virológicamente) ou rejeitada (com IgM negativo durante a convalescença). Consequentemente, esta foi a variável dependente (apresentar a doença confirmada). Por outra parte, as manifestações clínicas e os achados do hemograma (registrados até o sétimo dia da doença) foram as variáveis independentes.

Inicialmente, descreveu-se a frequência de cada um dos sinais e sintomas clínicos nos dois grupos de infecção, e usando medidas de tendência central, mostraram-se os parâmetros laboratoriais e outras variáveis continuas. Na análise bivariada foi utilizado o teste chi2 para comparação das variáveis categóricas e os testes t e Mann Whitney para variáveis contínuas.

Sendo que o objetivo principal era obter critérios práticos e bem definidos para a identificação clínica de dengue e para a tomada de decisões, todas as variáveis laboratoriais foram transformadas em categóricas. Para este fim, elas foram avaliadas na forma de decis para estabelecer a evolução da razão de chances (OR) de acordo com as variações quantílicas. Assim, foram estabelecidos o número e localização dos pontos de corte.

Posteriormente, foi feita uma análise multivariada empregando uma regressão logística e seguindo um método manual de seleção de variáveis para a frente (forward). Começou-se com a variável de maior significância

(menor valor de p) estatística e sequencialmente se avaliaram todas as variáveis com p ≤ 0,20 na análise bivariada. Medimos também se as variáveis sexo, idade e tempo de doença, modificaram as associações ou geraram uma mudança importante na medida de associação (≥ 10%), que foi o OR. Apenas as variáveis com p <0,05 foram mantidas no modelo. A qualidade do ajuste foi avaliada por estatística de Pearson e se fez uma avaliação do efeito das observações mais influentes.

Posteriormente, utilizando a função logit se obteve os coeficientes do modelo escolhido e estes foram divididos pelo logaritmo natural de 2 (0,69), a fim de determinar quantas vezes a presença da característica duplicava a chance de infecção por dengue. Este valor foi arredondado para o número inteiro mais próximo, e assim foi atribuída uma pontuação para cada preditor de dengue e, estabeleceu-se assim, uma escala de diagnóstico clínico. Para cada um dos valores desta escala foi calculada a probabilidade de infecção por dengue e as características operacionais de sensibilidade, especificidade e valores preditivos positivo e negativo (VPP e VPN, respectivamente), para o diagnóstico desta doença.

A área abaixo da curva ROC (ROC: receiver operating characteristic), como estimativa da utilidade da escala. Como referência utilizou-se uma escala feita com a soma das manifestações (um ponto por cada) de definição de caso suspeito da OMS (do ano 2000, ver antes). Então estas escalas foram comparadas utilizando a prova de igualdade de áreas ROC. Além disso, a área abaixo da curva ROC também foi empregada para fazer análise de subgrupos por faixas etárias (três categorias pré-definidas: <15 anos, 15 a 44 anos e ≥ 45 anos), por sexo e por tempo de doença no momento de admissão (antes ou após 72 horas desde o inicio da febre).

Como uma das preocupações é o diagnóstico precoce da doença, avaliaram-se indicadores de ajuste do modelo para os primeiros dias ou se havia uma justificativa para desenvolver um modelo alternativo e, portanto, outra escala para a identificação precoce do dengue. Assim, repetiram-se os procedimentos descritos acima, mas usando apenas as manifestações clínicas e de laboratorio identificadas na primeira avaliação do paciente.

Desta forma, obteve-se um modelo e uma escala baseada nas manifestações iniciais, que foram comparados com o modelo principal (feito com informações até o sétimo dia de doença) e sua escala correspondente. Para este fim, nós comparamos as suas áreas sob a curva ROC.

Finalmente, formularam-se uma definição de caso suspeito e outra de caso provável de dengue, que incluiram dois componentes:

1. Características de alta frequência da doença, a fim de descrever a população alvo.

2. A pontuação mínima na escala diagnóstica escolhida, a qual variou de acordo com os objetivos da definição. Ou seja, para caso suspeito se escolheu uma pontuação com alta sensibilidade (especialmente para os casos graves) e, para um caso provável, a pontuação mínima com uma especificidade acima de 90%. Para cada uma destas definições foram estimadas as caraterísticas operacionais para o diagnóstico do dengue e a sensibilidade para incluir casos de dengue com alguma complicação.

Finalmente, as definições de caso propostas neste estudo foram comparadas com aquelas da OMS, tanto a antiga quanto a nova (OMS, 2000 e 2009). Para estes fins, foram comparados os valores da acurácia, definida como a percentagem de casos corretamente classificados, utilizando a prova exacta de McNemar para proporções pareadas.

Análise Cluster