Variabilidade Genética em Mycobacterium leprae

Muitos esforços foram feitos para diferenciar isolados de M. leprae. Até o ano de 2000, análises por RFLP utilizando várias sondas não revelaram a existência de cepas dessa bactéria (Clark-Curtiss e col., 1985; Clark-Curtiss & Walsh, 1989; Sela e col., 1989; Williams

& Gillis, 1989). A análise de sequências de DNA entre as regiões 16S e 23S do RNA ribossomal também foram idênticas quando diferentes isolados de pacientes multibacilares foram analisados (de Wit & Klatser, 1994).

Embora o genoma de M. leprae contenha repetições dispersas, nenhum polimorfismo foi detectado nessas regiões (Woods & Cole, 1990). Todavia através de análises por PCR a sequência repetitiva RLEP foi a única que demonstrou certo potencial para diferenciação de isolados de M. leprae. Foram observadas diferenças de intensidade na amplificação e ausência da sequência repetitiva RLEP no gene pol(A) de certos isolados de M. leprae analisados (Fsihi & Cole, 1995). Até o momento, o potencial dessa sequência na diferenciação dos isolados não foi amplamente estudado.

Os achados anteriores impulsionaram as pesquisas por métodos de diferenciação entre isolados de M. leprae utilizando repetições em tandem de número variável. A primeira sequência em tandem com potencial polimórfico foi identificada por Matsuoka e colaboradores (2000). Nesse trabalho uma repetição de seis nucleotídeos foi encontrada no gene rpoT e pequenas variações de seu número de cópia foram observadas entre isolados provenientes de diferentes países. Amostras oriundas do Japão, Coréia e Brasil apresentavam três cópias dessa repetição enquanto que isolados de Haiti e Okinawa (Japão) apresentaram quatro cópias. Devido ao baixo polimorfismo observado esta sequência foi vista como um possível marcador geográfico.

Ainda em 2000, um trinucleotídeo (TTC) foi identificado e variações de número de cópias dessa repetição em amostras de pacientes hansenianos das Filipinas foram observadas:

num total de 34 amostras analisadas, 15 tipos de M. leprae foram definidos (Shin e col. 2000).

Alguns anos mais tarde, essa mesma sequência de trinucleotídeos foi utilizada para diferenciar amostras de pacientes hansenianos de uma área endêmica na Indonésia. Em alguns casos, foram observados genótipos diferentes entre indivíduos de uma mesma família o que poderia sugerir fontes de infecção diferentes para cada paciente (Matsuoka e col, 2004).

Com o objetivo de ampliar o painel de VNTRs utilizados para a diferenciação de isolados de M. leprae, Groathouse e colaboradores (2004) investigaram o polimorfismo genético de cinco minissatélites (6-7, 12-5, 18-8, 21-3 e 27-5) e seis microssatélites (C20, AT17, TA18, GTA9, TTC21 e CG6) através da análise de quatro amostras de DNA

23

purificado. Do total de VNTRs avaliados nove demonstraram-se polimórficos sugerindo assim, um conjunto de possíveis marcadores para diferenciação entre os isolados.

Ainda no ano de 2004, uma colaboração estabelecida entre o nosso grupo de pesquisa e pesquisadores da Universidade do Estado da Louisiana resultou num estudo no qual o polimorfismo e a estabilidade de quatro repetições em tandem foram avaliados. Os resultados obtidos demonstraram que os diferentes VNTRs analisados poderiam ser efetivamente utilizados na diferenciação de isolados de M. leprae (Truman e col, 2004).

Com o advento das pesquisas utilizando VNTRs, inúmeros estudos foram elaborados com o objetivo de investigar a diversidade genética entre isolados de M. leprae. Na Índia, um estudo foi conduzido utilizando três microssatélites (dois trinucleotídeos e um dinucleotídeo) e um número amostral de 33 pacientes. Nesse trabalho amostras de diferentes tecidos (biópsia de pele, linfa, muco nasal e células mononucleares de sangue) de sete pacientes foram também analisadas e o mesmo genótipo foi definido nos diferentes espécimes clínicos.

Todavia, quando essa comparação foi feita entre amostras de biópsia de pele e nervo, pequenas discordâncias foram observadas indicando dessa forma a presença de duas subpopulações de bactérias que teriam se expandido independentemente uma da outra.

(Young e col. 2004). Resultados similares foram observados pelo mesmo autor alguns anos mais tarde e a discordância entre genótipos de M. leprae em diferentes espécimes clínicos de um mesmo paciente parece estar associada à infecção por mais de um isolado, que teria possivelmente predileção por determinados tecidos (Young e col., 2008).

A análise de múltiplos loci contendo VNTRs tem demonstrando, ao longo dos anos, grande potencial para diferenciação de isolados de M. leprae. Com o objetivo de reduzir custos e ampliar o número de VNTRs estudados, Kimura e colaboradores (2009) propuseram uma análise baseada em PCR multiplex. Desta forma, a amplificação de diferentes VNTRs ocorre concomitantemente; oligonucleotídeos marcados com fluorescência são utilizados para que o número de cópias de cada repetição seja determinado através da análise do comprimento dos fragmentos gerados (do inglês FLA, “Fragment lenght analysis”). Este método é similar ao proposto para genotipagem de isolados de M. tuberculosis (Supply e col., 2006).

Desde 2009, trabalhos envolvendo a genotipagem de isolados de M. leprae utilizando PCR multiplex e FLA têm sido desenvolvidos em países como: Filipinas (Sakamuri e col., 2009), China (Xing e col., 2009; Weng e col., 2010), Colômbia (Cardona-Castro e col., 2009) e Brasil (Fontes e col., 2009). Desta forma, a variabilidade genética desse patógeno dentro das diferentes populações tem sido amplamente estudada.

24

Outra forma de variação genética observada no genoma de M. leprae são os polimorfismos de base única (SNP do inglês, “Single-nucleotide polymorphism”). Um estudo conduzido por Monot e colaboradores (2005) determinou a existência de quatro genótipos de M. leprae baseados em três possíveis SNPs (figura 1.4).

Figura 1.4. Genótipos de M. leprae definidos por SNPs (Monot e col., 2005).

Genótipo 1 é definido quando o nucleotídeo G estiver presente na posição 16422875pb; genótipo 2 é definido quando há a presença do nucleotideo T; genótipo 3 é definido quando há uma mutação na posição 2935685pb no genoma de M. leprae que resulta na substituição do nucleotídeo A por C; genótipo 4 é definido quando há uma mutação na posição 14676pb que resulta na substituição do nucleotídeo C por T. (Adaptado de Monot e col., 2005)

Os resultados obtidos demonstram um padrão muito semelhante de agrupamento filogenético. Além de detectar diferenças entre os isolados, esse estudo foi capaz de fornecer evidências para a formulação de hipóteses a respeito da rota disseminação da hanseníase.

Entretanto, algumas partes do mundo não foram representadas, sobretudo o Oriente Médio e a Europa. É sabido que estas regiões tiveram importância histórica no processo de migração humana.

Recentemente, outro estudo analisou amostras do Iran, Turquia, China, Coréia e Japão em busca de novos SNPs para uma maior compreensão dos mecanismos de disseminação da hanseníase entre pessoas e países (Monot e col., 2009). Um total de 400 amostras de 28 regiões foi analisado e 16 tipos de M. leprae definidos. Na verdade, os quatro genótipos anteriormente descritos (Monot e col., 2005) foram subdivididos nos demais subtipos. A distribuição global desses novos SNPs demonstrou uma estreita relação entre o genótipo de M. leprae, o país de origem e o padrão de migração humana. Os resultados confirmam a hipótese anterior de que a hanseníase teria se originado no leste da África, tendo se disseminado para Ásia, Meio Oeste, Europa e posteriormente para países da África central através do comércio de escravos (figura 1.5).

25

Figura 1.5. Disseminação da hanseníase pelo mundo (Monot e col., 2009)

As barras estão localizadas no país de origem de cada amostras analisada. As cores representam os quatro principais genótipos definidos e seus subtipos. A espessura das barras corresponde ao número de amostras analisado (barras finas:1-5 amostras; barras medianas: 6-29 amostras; barras mais amplas: mais de 30 amostras.) As setas cinza indicam as rotas humanas, com estimativa do tempo de migração em anos. Os pontos vermelhos indicam a localização da rota da seda.

A rota da seda que ligava Europa a China também parece ter contribuído para a disseminação da hanseníase no mundo. Nas Américas parece mais provável que a doença tenha sido trazida por imigrantes europeus e não via estreito de Bering. Esta interpretação é consistente com os achados paleontológicos que identificaram sinais da doença apenas em esqueletos do período pós-colonial (Ortner, 2003).

A análise filogeográfica de bactérias é uma ferramenta poderosa porque possibilita a compreensão da disseminação do patógeno e as movimentações do hospedeiro. Associações entre genótipos de cepas de H. pylori e seus locais de origem, bem como os processos de migração e etnia de seus hospedeiros têm sido estabelecidas (Falush e col., 2003; Wirth e col., 2004; Linz e col., 2007). Estudos com pacientes com tuberculose sugerem que determinadas linhagens desse patógeno se adaptaram a populações específicas (Gagneux e col., 2006).

Os resultados observados nos diferentes estudos sugerem que a variabilidade genética observada em M. leprae, através da utilização de VNTRs e/ou SNPs são ferramentas importantes e fazem parte de um novo campo de pesquisas que tem como objetivo elucidar importantes aspectos sobre a transmissão e disseminação desta doença pelo mundo.

26

CAPÍTULO II- OBJETIVOS