Variantes raras provavelmente patogênicas

No paciente SRS-13, foram identificadas duas microdeleções na região pseudoautossômica 1 (PAR1; Yp11.32), abrangendo cerca de 11 kb e 13 kb, respectivamente (chrY:732,030-742,796 / chrY:759,132-772,052; Figura II.9). Ambas foram herdadas do pai clinicamente normal. Não há genes mapeados nesse segmento cromossômico. Os segmentos deletados estão a cerca de 160 kb do gene SHOX. Esse gene codifica uma proteína com domínio homeo, que participa do ciclo celular e da regulação do crescimento e atua como ativador da transcrição em células osteogênicas (Benito-Sanz e col., 2005). Deleções em heterozigose ou mutações de perda de função desse gene, resultando em haploinsuficiência, são causas frequentes de discondrosteose de Léri-Weill (LWD; MIM #127300) e de baixa estatura idiopática (ISS; MIM #300582); já a perda de SHOX em homozigose resulta na displasia de Langer (LMD; MIM #249700), que tem quadro clínico mais grave (Sabherwal e col., 2007).

A LWD é uma displasia esquelética de herança dominante, caracterizada principalmente por baixa estatura desproporcional, encurtamento mesomélico e deformidade de pulso do tipo Madelung. Estima-se que deleções e mutações de ponto no gene SHOX sejam responsáveis por 50-70% dos casos da síndrome (Sabherwal e col., 2007). Em 2005, Benito- Sanz e col. identificaram 12 pacientes com LWD com uma nova classe de microdeleções, que não incluíam o gene SHOX. As microdeleções tinham tamanho entre 80 e 501 kb e foram mapeadas num segmento a aproximadamente 30-530 kb downstream do gene SHOX. Em todos os casos, as microdeleções segregavam com o fenótipo, estando ausentes em 70 indivíduos controle. O mapeamento das deleções permitiu delimitar uma região mínima de 29 kb comum a todas elas. Esses resultados sugeriram a existência de elementos reguladores da transcrição de SHOX. Dessa forma, as microdeleções downstream do gene SHOX podem alterar a expressão desse gene pela perda de elemento(s) regulador(es) ou ainda por efeito de posição (Benito-Sanz e col., 2005).

Continuando o estudo, o mesmo grupo de pesquisa (Huber e col., 2006) detectou microdeleções do gene SHOX e/ou da região downstream ao gene em 42 pacientes com LWD (68%) e 12 pacientes com baixa estatura idiopática (12%). Quatro novas microdeleções variáveis em tamanho e posição, mas abrangendo a região downstream de SHOX (uma delas incluindo parte do gene) foram observadas (três pacientes LWD e um ISS; aproximadamente 3% da amostra total). Comparando-se os resultados com aqueles previamente relatados, os autores conseguiram definir uma região extragênica mínima deletada de 10,5 kb.

Figura II.9 - Microdeleções em Yp11.32 detectadas no paciente SRS-13, por aCGH (plataforma 180K, OGT). (A) As microdeleções, em verde, abrangem aproximadamente 11 kb e 13 kb. (B) Segmentos deletados visualizados no Genome Browser do UCSC: coordenadas genômicas no hg19; track de genes do RefSeq; segmentos deletados no paciente em vermelho, as barras largas representando os segmentos comprovadamente deletados e as barras finas, segmentos possivelmente deletados; microdeleção recorrente de 47 kb descrita na literatura; custom track de enhancers (CNE2-CNE9, em roxo) localizados na região downstream do gene SHOX; track de conservação de bases de DNA nos vertebrados de acordo com phyloP.

A

Em 2007, Sabherwal e col. descreveram quatro pacientes com LWD, que possuiam microdeleções localizadas entre 48 e 215 kb downstream do gene SHOX. Esses desequilíbrios cromossômicos estavam presentes em todos os afetados das famílias, mas não nos membros clinicamente normais ou em 100 controles da população geral. Após análise genômica comparativa, os autores identificaram oito elementos não codificadores altamente conservados evolutivamente (CNE - Conserved Noncoding DNA Elements), e os nomearam CNE2 a CNE9. Estudos funcionais desses CNE revelaram que três deles (CNE4, CNE5 e CNE9) tinham atividade regulatória in cis no desenvolvimento de membros, em embriões de galinha e cinco (CNE3, CNE4, CNE5, CNE7 e CNE9) tinham a capacidade de ativar a expressão de gene repórter em tubo neural, evidenciando que funcionavam como enhancers (Sabherwal e col., 2007).

Para estabelecer a frequência e a importância dos elementos reguladores de longa distância também em indivíduos com ISS, Chen e col. (2009) analisaram 735 pacientes com ISS de origens étnicas diferentes, comparando-os a 58 pacientes com LWD e 100 indivíduos controles. Observaram que as deleções de enhancers de SHOX constituem causa relativamente frequente dessas duas condições clínicas: dentre as 31 (4,2%) microdeleções identificadas em pacientes com ISS, oito (8/31; 26%) localizavam-se na região downstream e abrangiam somente os enhancers CNE7, CNE8 e/ou CNE9, as demais incluindo o gene; entre os pacientes com LWD, 29 microdeleções (50%) foram detectadas e 13 delas (13/29; 45%) estavam localizadas na região downstream de SHOX. Nenhuma deleção foi encontrada nos 100 indivíduos controle. No total, 4,9% dos pacientes com ISS e 56,7% dos pacientes com LWD apresentaram mutações de ponto ou deleções de SHOX ou sua região reguladora. Como as deleções downstream do gene ocorrem mais frequentemente entre os pacientes com LWD quando comparados àqueles com ISS, foi considerada a possibilidade de que deleções de

enhancers resultem em fenótipo mais pronunciado. Reunindo os resultados dos estudos que

investigaram deleções no gene SHOX desde 2005 (Benito-Sanz e col., 2005; Huber e col., 2006; Fukami e col., 2006; Sabherwal e col., 2007; Chen e col., 2009), verificou-se que CNE9 provavelmente represente o enhancer mais importante na região reguladora de SHOX e que a deleção do segmento abrangendo CNE7 e CNE8, ou de CNE8 isoladamente, pode ser identificada em pacientes com baixa estatura, ou com defeitos esqueléticos (Chen e col., 2009).

No paciente SRS-13, a posição da microdeleção mais proximal indica que o enhancer CNE8 está deletado, mas a deleção pode-se estender até CNE9. A microdeleção mais distal pode abranger a sequência do enhancer CNE7 (Figura II.9). Não há relato de indivíduos

normais portadores de microdeleções semelhantes (DGV). O paciente apresentou restrição de crescimento intrauterino, baixo peso e baixa estatura (< 5º percentil), face triangular e frontal amplo. No DECIPHER, estão documentados 10 pacientes portadores de variantes semelhantes: sete microdeleções se estendem por cerca de 12 kb, abrangem somente o primeiro segmento (chrY:732030-744392) e foram consideradas provavelmente benignas; as outras três são maiores (cerca de 40, 160 e 238 kb) e englobam as duas microdeleções detectadas no paciente SRS-13, duas delas tendo sido consideradas VOUS e uma, provavelmente patogênica. Ambos os pacientes com variantes consideradas VOUS apresentavam baixa estatura proporcional, entre seus sinais clínicos. No ClinGen, há relato de dois pacientes com microdeleções de aproximadamente 38 kb, consideradas provavelmente benignas.

Em 2012, foi descrita a primeira microdeleção recorrente na região reguladora

downstream do gene SHOX (Benito-Sanz e col., 2012b; Figura II.9). Os autores investigaram

124 pacientes com LWD e 576 com ISS. A microdeleção recorrente de 47,5 kb foi identificada em 30 famílias não relacionadas, sendo 19 com LWD (15.3%) e 11 com ISS (1.9%). A microdeleção segregou com o fenótipo em nove famílias, mas a análise foi inconclusiva nas outras 21 famílias, devido à presença de baixa estatura em ambos os pais, à impossibilidade de analisar os genitores ou à falta de dados clínicos. A microdeleção não foi detectada em amostra de 334 indivíduos com altura normal. Uma análise de conformação cromossômica (3C), em membros de embrião de galinha, indicou potencial atividade regulatória de SHOX pelo elemento ECR1, que corresponde ao elemento CNE7, descrito anteriormente (Sabherwal e col., 2007). Ainda, um ensaio funcional com o gene repórter luciferase em células humanas U2OS confirmou que o elemento ECR1/CNE7 funciona como

enhancer de SHOX. O elemento ECR1/CNE7 está mapeado no segmento de 47,5 kb deletado

nos pacientes com LWD e ISS; portanto, a perda do enhancer pode levar a diminuição da expressão do gene SHOX, resultando no fenótipo alterado.

A semelhança entre a microdeleção recorrente de 47,5 kb e as microdeleções detectadas no paciente SRS-13 (Figura II.9) indica que elas podem compartilhar pontos de quebra. Dessa forma, a microdeleção distal do nosso paciente deve englobar o elemento regulador ECR1/CNE7, o que explicaria o seu fenótipo de baixa estatura.

Embora as microdeleções do paciente SRS-13 sejam herdadas de seu pai clinicamente normal, o possível efeito patogênico dessas variantes não pode ser ignorado. Em 1982, Dawe e col. relataram que a LWD tem penetrância incompleta (cerca de 50%). Mais recentemente, foi descrito que a penetrância da LWD parecia ser incompleta em famílias onde segregava a

mutação de SHOX (Munns e col., 2003). Além disso, mutações idênticas no gene SHOX podem originar fenótipos distintos (ISS ou LWD), sugerindo complexa heterogeneidade genética e clínica, que pode incluir genes modificadores, interações epigenéticas e efeitos estocásticos (Rappold e col., 2002). Por último, uma microdeleção recorrente de 47,5 kb na região downstream do gene SHOX está associada com LWD (com expressividade variável) ou ISS, e tem clara penetrância incompleta em diversas famílias (Benito-Sanz e col., 2012b; Bunyan e col., 2013). Assim, as microdeleções detectadas no paciente SRS-13 podem ser consideradas como provavelmente patogênicas.