Verificação da fase do ciclo celular, fragmentação de DNA e proliferação

No ensaio de verificação do ciclo celular obtivemos a quantidade de células em cada fase do ciclo (G1, S, G2/M) que estão representados nos histogramas abaixo (Figura 9).

Figura 9 Histogramas da verificação das fases do ciclo celular de células de câncer de pele melanoma de murino (B16F10) marcadas com iodeto de propídio, sendo os grupos controle (CTL) e as células tratadas com nanoemulsões de óleo de açaí na concentração de 360 µg/mL com (AÇPEG) e sem PEG (NE-).

Na figura 10 podemos observar o padrão de ciclo celular das células B16F10 quando submetidas a citometria de fluxo. A porcentagem de células em cada etapa do ciclo celular (G1, S, G2/M) foi comparada com o controle que obteve 60,4% das células em fase G1, 17,7% em fase S e 21,8% em fase G2/M. Os grupos de amostras de nanoemulsão de óleo de açaí, AÇNE e AÇPEG, obtiveram diferença significativa da quantidade de células nas fases do ciclo celular. Podemos observar um aumento da porcentagem de células em fase G1 nos dois grupos (AÇNE e AÇPEG), o que ocasiona uma diminuição da proporção de células nas outras fases do ciclo. A amostra AÇNE aumentou 10% a proporção de células na fase G1, enquanto a AÇPEG induziu um aumento de 17%.

O grupo L-, contendo apenas lecitina, apresentou diferença significativa na fase G2/M com 3% a menos de células, quando comparada ao controle. No entanto, o

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grupo AÇNE diminuiu 7% do número de células nesta fase, fazendo com que houvesse diferença significativa entre estes grupos, sendo a AÇNE mais eficaz em parar o ciclo celular na fase G1 e diminuir na fase G2/M,do que o branco L- fazendo- nos concluir que o óleo de açaí possui ação no ciclo celular.

Quando comparadas entre si, a AÇPEG obteve melhor resposta na mudança do perfil do ciclo celular do que a AÇNE.

Cont role AÇNE AÇPE G L- PEG O.L 0 50 100 G1 S G2/M *** *** * ** ** *** *** *** *** *** P o rc e n ta g e m d e c é lu la s ( % )

Figura 10 Avaliação do ciclo celular por Citometria de fluxo após 24 horas de exposição às AÇNE (nanoemulsão de açaí), AÇPEG (nanoemulsão de óleo de açaí associada a polietileno glicol), O.L (óleo de açaí), L- (surfactante), e PEG (polietileno glicol e surfactante) a 360 µg/mL de células de câncer de pele melanoma (B1610). Teste ANOVA e pós-teste Tukey, diferença significativa quando comparado com o grupo controle (***: P<0,0001).

A avaliação da fragmentação de DNA por citometria de fluxo está disposta na figura 11, onde pode-se observar que os grupos de nanoemulsão AÇNE e AÇPEG e o óleo livre (O.L) aumentaram a porcentagem de células com DNA fragmentado, e no caso das nanoemulsões, também diminuíram o número de células com DNA íntegro (Figura 10). Os achados nesse estudo de fragmentação do DNA corroboram com os encontrados no ensaio de ciclo celular. Segundo Fofaria e colaboradores (2014), o dano ao DNA representado neste estudo pelo DNA fragmentado faz com que as células fiquem aprisionadas na fase G1 a fim de que não continuem o ciclo celular devido a defeitos no material genético. Caso o dano seja reparado as células seguem

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o ciclo celular, caso contrário, entram em processo de apoptose. Em um estudo, o extrato de piperina foi testado e foi capaz de manter as células em fase G1 e causar apoptose nas células de câncer de pele melanoma B16F10 e SK MEL 28 (FOFARIA et al, 2014).

No estudo de Araújo (2017), foi observado parada do ciclo celular na fase G1 de células de câncer de pele não-melanoma A431 causada por tratamento com nanoemulsões de óleo de açaí e também em combinação com ácido anacárdico. Em outro estudo células de câncer de pele melanoma B16F10 expostas a nanoemulsão de óleo de açaí e terapia fotodinâmica apresentaram perfil de morte celular por apoptose tardia/necrose.(MONGE-FUENTES, 2016) Con trol e AÇ NE AÇ PE G L- PEG O.L 0 2 4 6 8

***

***

***

Figura 11 Avaliação da fragmentação de DNA por Citometria de fluxo após 24 horas de exposição às AÇNE (nanoemulsão de açaí), AÇPEG (nanoemulsão de óleo de açaí associada a polietileno glicol), O.L (óleo de açaí), L- (surfactante), e PEG (polietileno glicol e surfactante) a 360 µg/mL de células de câncer de pele melanoma (B1610). Teste ANOVA e pós-teste Tukey, diferença significativa quando comparado com o grupo controle (***:P<0,0001).

No ensaio de azul de tripan para avaliação do número total de células, os grupos analisados não apresentaram diferença significativa quando comparadas ao controle (Figura 12). Pode-se notar apenas uma tendência à diminuição do número

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total de células que pode indicar iní]cio de morte celular ou parada no ciclo celular. Este dado não exclui a diminuição da viabilidade celular já que o ensaio de MTT avalia a capacidade da mitrocôndria reduzir o MTT em cristais de formazan. Portanto, pode acontecer das mitocôndrias estarem anormais, mas as células não entraram ainda em processo de morte. CTL AÇ NE AÇ PE G O.L L- _PEG 0 1000000 2000000 3000000 4000000 Grupos Experimentais Nú m e ro to ta l d e c é lu la s

Figura 12 Avaliação por Azul de tripan do número total de células de câncer de pele melanoma B16F10 após exposição por 24 horas às AÇNE (nanoemulsão de açaí), AÇPEG (nanoemulsão de óleo de açaí associada a polietileno glicol), O.L (óleo de açaí), L- (surfactante) e PEG (polietileno glicol e surfactante) a 360 µg/mL. Contagem das células em câmara de Neubauer. Não se observou diferença significativa quando comparado com o controle (CTL) em teste ANOVA e post-teste Tukey.

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6. Conclusão e perpectivas

O óleo de açaí constitui uma fonte rica em compostos bioativos com propriedades antioxidantes e atividade antitumoral já descritas. A fim de melhorar a eficácia do tratamento com biocompostos como óleos, que possuem características físico-quimicas limitantes (hidrofobicidade e oxidação por luz), o uso de nanoestruturas como as nanoemulsões mostra-se uma alternativa inovadora. Com a possibilidade de associar-se tais estruturas a polímeros como o polietileno glicol, aumenta-se as vantagens destes tratamentos em células tumorais como é o caso do câncer de pele melanoma.

Neste estudo, o uso de nanoemulsões de óleo de açaí associadas ou não a polímero PEG no tratamento de câncer de pele melanoma, in vitro, reduziu a viabilidade da linhagem celular B16F10,causaram parada no ciclo celular na fase G1 e aumentaram a proporção de células com fragmentação de DNA. Além disso, após 24 horas de exposição, não foi possível observar lesão de membrana plasmática.

Em conjunto, esses dados sugerem um mecanismo de morte celular por apoptose e bloqueio do ciclo celular. Entretanto, outros estudos são necessários para confirmar a suposição de mecanismo de ação por apoptose, tais como ensaios de caspase, Anexina V, além da investigação da atividade das nanoemulsões de óleo de açai sobre o perfil de invasão e metástase das células de câncer de pele melanoma.

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