infecção
Camundongos Swiss infectados com 5x103 formas tripomastigotas da
cepa Y do T. cruzi
Tratamento: Dose única de 500mpk do composto em teste ou do Bz Exames de sangue a fresco e Mortalidade durante 30 dias Atividade igual ou superior a do Bz passa pra próximaavaliação Camundongos Swiss infectados com 5x103 formas tripomastigotas da cepa Y do T. cruzi
Tratamento por 7 dias com o composto em teste (doses de 100,200 e 300mpk) ou do Bz (100mpk) Exames de sangue a fresco e Mortalidade durante 37 dias Atividade igual ou superior a do Bz passa pra próxima avaliação Camundongos Swiss infectados com 5x103 formas tripomastigotas da cepa VL-10 e Colombiana do T. cruzi
Tratamento por 20 dias com o composto em teste (na dose ótima) ou
do Bz -100mpk
Exames de sangue a fresco antes e após
Imunossupressão; PCR; HC; Sorologia e
Histopatologia e Mortalidade durante
200 dias
Tratamento na fase aguda
Camundongos Swiss infectados com 5x102 formas tripomastigotas da
cepa VL-10 do T. cruzi
Tratamento por 20 dias com o composto em teste (na dose ótima) ou
do Bz -100mpk
Exames de sangue a fresco antes e após
Imunossupressão; PCR; HC; Sorologia e
Histopatologia e Mortalidade durante
200 dias
Tratamento na fase crônica Camundongos Swiss
infectados com 5x103 formas tripomastigotas da
cepa Y do T. cruzi
Tratamento por 20 dias com o composto em teste (na dose ótima) ou
do Bz -100mpk
Exames de sangue a fresco antes e após
Imunossupressão; PCR; HC e Mortalidade durante
200 dias Atividade igual ou superior a do Bz passa pra próxima avaliação
Isabel Mayer de Andrade Animais, Material e Métodos
3.5 – Padronização do protocolo para a avaliação da atividade tripanocida de novos compostos.
Inicialmente foi realizada a padronização de um protocolo visando o estabelecimento de condições ideais para a triagem inicial da atividade tripanocida de novos compostos. Este protocolo visa à utilização de tratamentos curtos, e conseqüentemente, o uso de um menor número de animais; de uma menor quantidade do composto avaliado; de um menor tempo de avaliação.
Neste protocolo foram propostos dois ensaios seqüenciais, de curta duração, para a triagem de novos compostos, tendo cada um deles os seguintes objetivos: (i) a identificação da atividade tripanocida de um composto, utilizando um esquema terapêutico de dose única; (ii) a definição da dose ideal de cada composto, utilizando um esquema terapêutico de curta duração.
Duas drogas foram selecionadas para esta padronização: (i) Benznidazol (Bz) – a droga de referência para o tratamento da doença de Chagas, com alta atividade anti-T. cruzi (Filardi & Brener, 1987); e o (ii) Itraconazole (Itz) – um composto com atividade anti- T. cruzi, mas que induz um menor índice de cura em camundongos em relação ao Bz (Toledo et al, 2003).
A cepa escolhida foi a Y, visto que essa cepa é parcialmente resistente ao tratamento com Bz (Filardi & Brener, 1987), apresenta alto nível de parasitemia, com pico no 8o dia de infecção e mortalidade de 100% dos animais entre o 12o e 20o dia de infecção. Estas características permitem a rápida definição da capacidade do composto avaliado em reduzir ou suprimir a parasitemia e a mortalidade dos animais.
Para a definição da dose dos fármacos que deveria ser utilizado na avaliação da atividade tripanocida (dose única) foram alocados 6 animais por grupo, inoculados com 5x103 formas tripomastigotas sanguineas da cepa Y do T. cruzi e tratados com 50, 100 e 500 mg/kg de peso (mpk) de Bz e Itz. Outros 6 animais foram mantidos como grupo controle infectado e não tratado.
Ambos os compostos foram administrados oralmente, por gavagem, em uma suspensão a 4% com goma arábica. O tratamento oral foi iniciado imediatamente após a detecção do parasito pelo exame de sangue a fresco, que nos animais infectados com a cepa Y ocorre sempre no 4o dia após a inoculação.
A atividade tripanocida foi determinada usando os parâmetros: (i) supressão da parasitemia, (ii) nível de parasitemia após o término do tratamento (iii) taxa de
mortalidade. Neste caso, a dose que fosse capaz de diferenciar o efeito do tratamento induzido pelos dois compostos utilizados nesta padronização, Bz e Itz, seria escolhida.
A parasitemia dos animais foi avaliada diariamente até o 10o dia após o tratamento, sendo, a seguir avaliada a cada 2 dias até o 30o dia após o tratamento por exame de sangue a fresco. O sangue dos animais foi coletado da veia da cauda e o número de parasitos determinado pela técnica descrita por Brener (1962). A taxa de mortalidade foi expressa pela percentagem cumulativa de mortes no período de 30 dias após o tratamento.
A segunda série de experimentos foi designada para a identificação das condições ideais para a definição da dose ótima de cada composto. Neste experimento grupos de 6 animais infectados com 5x103 formas tripomastigotas sanguineas da cepa Y foram tratados por 3, 5, 7 e 10 dias com 100mpk de Bz e Itz. Esta dose foi previamente definida como a dose ótima para o tratamento da infecção murina (Filardi & Brener, 1987, Toledo et al., 2003). Os animais foram avaliados como no experimento anterior. Porém, o número de doses utilizado na avaliação dos novos derivados nitroimidazois foi aquele que quando utilizado com o Bz e o Itz, ambos os compostos apresentaram perfis similares de: supressão da parasitemia, e período de reativação da mesma e taxa de mortalidade.
Os experimentos foram repetidos 3 vezes para verificar a reprodutibilidade dos resultados.
3.6 - Avaliação da atividade tripanocida de derivados nitroimidazólicos, denominados DNDi-IM2, DNDi-IM3, DNDi-IM4 e do Fexinidazol.
Para a determinação da atividade anti-T. cruzi dos derivados nitroimidazólicos foram usados 4 ensaios seqüenciais: (i) avaliação da eficácia do composto em suprimir ou reduzir a parasitemia e a taxa de mortalidade, (ii) avaliação da dose ideal de cada composto; (iii) avaliação da eficácia de cada composto em induzir cura parasitológica em animais infectados com a cepa Y, que é parcialmente resistente ao Bz (Filardi & Brener, 1987). (iv) análise da eficácia da terapeutica sobre as cepas VL-10 e Colombiana, ambas resistentes ao Bz (Filardi & Brener, 1987), tanto na fase aguda como na fase crônica da infecção. O critério para que o composto progredisse na
Isabel Mayer de Andrade Animais, Material e Métodos
avaliação era que apresentasse atividade tripanocida igual ou superior ao Bz e/ou Itz, as drogas de referência.
Os ensaios i e ii foram realizados de acordo com o protocolo definido no tópico 3.5. No experimento iii, designado para definir a eficácia do composto em induzir cura parasitológica em camundongos infectados com 5x103 formas tripomastigotas sanguineas da cepa Y do T. cruzi. Os animais foram alocados em grupos de 10 animais, sendo, 10 tratados com o composto avaliado, 10 tratados com o Bz e 10 mantidos como controle infectado e não tratado.
Os animais foram tratados por 20 dias consecutivos a partir da confirmação da infecção, sendo utilizada, para cada composto avaliado, a dose ótima definidano experimento ii. O Bz foi administrado utilizando o esquema terapêutico de referência de 100mpk, definido por Filardi & Brener (1987). Os resultados dos experimentos realizados com a dose ótima de cada composto foram comparados com os do tratamento padrão com Bz.
3.7 - Controle de cura
A cura parasitológica foi determinada de acordo com a metodologia padronizada por Caldas et al., (2008) baseada em 3 testes independentes: exame de sangue a fresco antes e após imunossupressão com ciclofosfamida, seguida pelos testes de hemocultura e PCR realizados no 1o e no 6o mês após o tratamento no sangue de camundongos com resultados negativos no exame de sangue a fresco. Os animais foram considerados curados quando apresentaram resultados negativos em todos os testes realizados (Figura 1).
Exame de Sangue a fresco – O exame de sangue a fresco foi realizado no sangue coletado da veia caudal dos camundongos, sendo a quantificação dos parasitos realizados segundo a técnica descrita por Brener (1962).
Figura 1- A parasitemia foi avaliada durante e até 30 dias após o tratamento para detectar a ocorrência da supressão da parasitemia e a reativação natural da parasitemia após o término do tratamento (Exame de Sangue a Fresco). Os animais que não apresentaram a reativação da parasitemia após a tratamento foram submetidos a 3 ciclos de 50mpk de Ciclofosfamida (Baxter Oncology, Alemanha) (CI-I), sendo cada ciclo de 4 dias consecutivos, com intervalo de 3 dias entre cada ciclo. A parasitemia foi avaliada diariamente durante a imunossupressão e até 10 dias após seu fim. A hemocultura e a PCR foram realizadas no 1o e no 6o mês após o tratamento apenas nos animais que apresentaram resultados negativos nos testes anteriores.
Hemocultura – Foram coletados aproximadamente 400µL de sangue não heparinizado e transferido, para um tubo falcon de 15mL contendo 3 mL de meio LIT (Liver Infusion Tryptose). Estes tubos foram incubados a 28°C e suavemente homogeneizados semanalmente. As hemoculturas foram examinadas ao microscópio quando completados 30, 60, 90 e 120 dias após a sua realização para a detecção de parasitos.
PCR (Reação da Cadeia Polimerase) – Foram coletados 200µL de sangue e misturados a igual volume da solução de guanidina a 6M- HCl/0.2M EDTA (Avila et al., 1991). As amostras foram mantidas a temperatura ambiente e após sete dias foram fervidas por sete minutos para promover a linearização dos minicírculos do k-DNA permitindo a distribuição homogênea das seqüências alvo presentes na amostra (Brito et al., 1993). As amostras fervidas foram armazenadas em temperatura ambiente até a realização da extração do DNA.
Foi utilizada a técnica proposta por Sambrook et al. (1989) com algumas modificações realizadas por Gomes et al. (1998). Alíquotas de 200L do lisado de sangue foram transferidas para tubos de microcentrífuga (eppendorf-USA), sendo em seguida desproteinizado com igual volume de fenol-clorofórmio (v/v). A mistura foi homogeneizada lentamente por 2 minutos e centrifugada a 4400g por 5 minutos. O sobrenadante foi retirado e ao sedimento foram adicionados 150L de água milli-Q estéril e novamente centrifugado a 4400g por 5 minutos. Em seguida, a fase aquosa foi purificada com clorofórmio (v/v) e o DNA presente nessa fase foi precipitado com dois
Isabel Mayer de Andrade Animais, Material e Métodos
volumes de etanol absoluto gelado e 10mM de acetato de sódio em banho de gelo, por 15 minutos. Após centrifugação, a 5720g, por 15 minutos, o sobrenadante foi descartado e após a volatilização do etanol, o DNA obtido foi ressuspendido em 20L de água milli-Q estéril e estocado a 4oC.
As reações de amplificação foram realizadas em um volume final de 10L contendo 10mM Tris-HCl (pH 9,0), 0,1% Triton X-100, 3,5mM MgCl2, 75mM KCl, 0,2mM de cada dNTP’s (Pharmacia Biotech), 1,0 unidade de Taq DNA polimerase (Invitrogen), 20pmol de cada iniciador
[S35(5’AAATAATGTACGGG(T/G)GAGATGCATGA3’) e 36
(5’GGGTTCGATTGGGGTTGGTGT3’) (OPERON Technologies, INC)] descritos por Ávila et al., (1990). A mistura foi coberta com 20L de óleo mineral.
Foram realizados 35 ciclos de amplificação em um termociclador automático (MinCycler TM). As condições da reação foram: desnaturação do DNA a 95º C por 1 minuto (com etapa inicial mais longa por 5 minutos), anelamento dos iniciadores a 65ºC por 1 minuto, extensão a 72ºC por 1 minuto com etapa final de 10 minutos. As etapas de extração do DNA e mistura da reação da PCR foram monitoradas com controles negativos (amostras de sangue de camundongos não infectados) e positivos (camundongos infectados na fase aguda da infecção). Além disso, para evitar contaminações, cada etapa da reação foi realizada em ambientes separados, utilizando reagentes e equipamentos destinados exclusivamente para cada uma das mesmas.
Os produtos amplificados pela PCR foram analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida a 6% e revelados pela coloração de nitrato de prata a 0,2% para a visualização dos fragmentos amplificados (Santos et al., 1993).
3.8 - Influência do tratamento específico nos níveis de anticorpos da classe IgG
Esta avaliação foi realizada apenas no sangue dos camundongos infectados pelas cepas VL-10 e Colombiana, resistentes ao tratamento com Bz.
A dosagem de anticorpos da classe IgG foi realizada pela técnica ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay). Foram coletados em média 500µL de sangue não heparinizado do seio venoso retro-orbital dos camundongos e transferido para tubos
eppendorf de 1,5mL, sendo estes centrifugados a 1320g. O soro foi armazenado em novo tubo e estocado a -80°C.
Os ensaios de ELISA foram realizados segundo a metodologia descrita por Voller et al., (1976) utilizando microplacas de poliestireno de 96 poços de fundo chato, sensibilizadas com 100µL/poço de antígeno obtido da forma epimastigota da cepa Y do T. cruzi, obtidos de cultivo acelular em meio LIT. O antígeno foi diluído em tampão carbonato de pH 9,6 e incubadas overnight a 4°C.
Após a incubação o excesso da solução antigênica foi desprezado e as placas foram lavadas com PBS-Tween. Em seguida as placas foram bloqueadas com 100µL/poço de PBS com soro fetal bovino e incubadas por 30minutos a 37°C. Depois foram submetidas à nova lavagem, e realizada nova etapa de incubação com 100µL/poço do soro dos camundongos, na diluição de 1:80, durante 45 minutos a 37°C. As placas foram novamente lavadas e incubadas com 100µL/poço do conjugado anti- IgG de camundongo marcado com peroxidase. Em seguida as placas foram lavadas novamente, e adicionado 100µL/poço de solução de substrato (3mg de orto-fenileno- diamino, OPD, com 3µL de água oxigenada 30 volumes e 15mL de tampão citrato- fosfato) e incubadas a 37°C por 10minutos. A reação foi interrompida com adição de 32µL de H2SO4 a 2,5M.
A leitura da reação foi feita em leitor de ELISA (Soft Max Pro 4.0 – Life Sciences Edition). Em todas as placas foram incluídos 2 soros de controles positivos e 10 soros de controles negativos. A absorbância discriminante foi determinada pela média dos 10 soros controle negativos somados a dois desvios padrão (Gusmão et al., 1982). Foi considerado positivo aquele que teve a leitura de densidade ótica maior que a absorbância discriminante.
3.9 – Análise quantitativa do infiltrado inflamatório no tecido cardíaco.
Esta avaliação foi realizada no coração dos camundongos infectados pelas cepas VL-10 e Colombiana, resistentes ao tratamento com Bz.
Os animais dos diferentes grupos experimentais (infectados e não tratados, infectados e tratados com os diferentes compostos e não infectados) foram eutanasiados
Isabel Mayer de Andrade Animais, Material e Métodos
180 dias após o tratamento. A eutanásia foi realizada através do deslocamento cervical, e posteriormente foi realizada uma incisão ventral, para a retirada do coração.
Os corações coletados dos camundongos foram fixados em solução tamponada de formol 10% (formol P.A. 100 mL, fosfato monossódico monohidratado 4 g, fosfato dissódico anidro 6,5 g, água destilada 900 mL), desidratados e embebidos em parafina. Em seguida os blocos foram cortados em secções de 4µm de espessura.
Cortes seriados de fragmentos cardíacos de cada camundongo foram desparafinizados em banhos de xilol, hidratados em soluções alcoólicas de diluições crescentes, corados pela hematoxilina e em seguida pela eosina. Posteriormente as lâminas foram confeccionadas com o auxílio de entellan.
A análise dos cortes histológicos do coração dos camundongos foi realizada a partir da quantificação do número de núcleos celulares. Foram analisadas 20 imagens (campos) aleatórias de cada camundongo, sendo a área total percorrida igual a 1,49 x106 µm2.
As imagens foram obtidas pela objetiva de 40 e digitalizadas através de microcâmera Leica DM 5000 B (Leica Application Suite, versão 2.4.0R1) e processadas por meio do programa analisador de imagens Leica Qwin V3.
3.10 - Análise Estatística
Os resultados dos níveis de parasitemia, de anticorpos e da análise morfométrica foram expressos como a média + o desvio padrão para cada teste. Estas variáveis foram analisadas pelo teste não paramétrico Tukey de múltipla comparação. Os dados foram considerados significativos quando a probabilidade de erro foi menor que 5% (p< 0,05).
Isabel Mayer de Andrade Resultados
4 – Resultados
4.1 – Padronização do protocolo para a avaliação da atividade anti-
Trypanosoma cruzi de novos compostos.
Na etapa inicial deste estudo foi padronizado um protocolo para a determinação da atividade anti-T. cruzi de novos compostos. Neste protocolo foram propostos quatro ensaios seqüenciais: (i) avaliação da eficácia do composto em suprimir ou reduzir a parasitemia e a mortalidade; (ii) determinação da dose do composto que induz a maior redução da parasitemia e da mortalidade; (iii) avaliação da eficácia do composto testado em induzir cura parasitológica em camundongos infectados com a cepa Y do T. cruzi, considerada parcialmente resistente ao Bz (Filardi & Brener, 1987); (iv) análise da eficácia da terapeutica em animais infectados com as cepas VL-10 e Colombiana, ambas resistentes ao Bz (Filardi & Brener, 1987), tanto na fase aguda como na fase crônica da infecção. O critério adotado para o composto progredir na avaliação foi a presença de atividade tripanocida igual ou superior ao Bz ou ao Itz, as drogas de referência.
Para verificar se a metodologia proposta foi capaz de detectar níveis variáveis de atividade tripanocida camundongos infectados pela cepa Y foram tratados com Bz ou Itz. Estas drogas foram escolhidas por apresentarem diferentes níveis de atividade anti- T. cruzi.
No experimento i os camundongos infectados com a cepa Y foram tratados com uma dose única de 50, 100 ou 500mg por kg de peso corporal (mpk) de Bz ou Itz. Neste experimento foram avaliados os seguintes parâmetros: (i) supressão da parasitemia; (ii) tempo para a reativação da parasitemia; (iii) redução da mortalidade.
Os resultados obtidos permitiram verificar que nos animais tratados com 50 e 100mpk foi observada redução da parasitemia e da mortalidade dos camundongos tratados com ambas as drogas, entretanto, de acordo com os parâmetros avaliados, não foi possível diferenciar o nível de atividade tripanocida dos dois compostos (Figura 2 A e B). Por outro lado, quando os animais foram tratados com uma única dose de 500mpk foi possível diferenciar a atividade tripanocida do Bz e Itz. Nos animais tratados com Bz foi observada a supressão da parasitemia e da mortalidade. Nestes animais a reativação da parasitemia ocorreu em torno do 4o dia após o tratamento. De forma diferente, nos
animais tratados comItz foi observada apenas a redução da parasitemia, tendo o pico de parasitemia ocorrido no mesmo dia do controle infectado não tratado, mas em níveis significativamente menores (Figura 2C). Além disso, no tratamento realizado com 500mpk foi detectado 100% de mortalidade nos animais tratados com Itz, não tendo sido detectada morte entre os animais tratados com a mesma dose de Bz.
0 5 10 15 20 25 30 0 100 200 300 400 500 500 1000 1500 2000 2500 A 0 5 10 15 20 25 30 0 100 200 300 400 500 B 500 1000 1500 2000 2500 0 5 10 15 20 25 30 0 100 200 300 400 500 500 1000 1500 2000 2500 C P a ras it o s/ 0, 1 m L d e san g u e
Dias após a infecção
Figura 2 – Média da parasitemia de 6 camundongos infectados com 5 x 103 formas tripomastigotas da cepa Y do Trypanosoma cruzi, submetidos ao tratamento com uma dose única de 50(A), 100(B) ou 500(C) mpk de Benznidazol (círculos brancos) ou Itraconazol (círculos cinza). O grupo controle infectado está representado pelos círculos pretos. As setas indicam o dia do tratamento.
Considerando estes resultados, nas etapas seguintes deste estudo foi utilizado o tratamento em dose única de 500mpk para a determinação da presença de atividade anti- T.cruzi dos compostos avaliados, usando como referência o Bz.
Em seguida foi realizada a padronização do protocolo que seria utilizado para a definição da dose do composto avaliado. Neste caso, a segunda série de experimentos foi realizada com o objetivo de definir o número mínimo de doses de cada composto que seriam necessárias para induzir a supressão da parasitemia e da mortalidade de camundongos infectados pela cepa Y do T. cruzi. Neste experimento foram utilizados o Bz e o Itz, nas doses de 100mpk (tratamento padronizado por Filardi & Brener, 1987 e por Toledo et al., 2003).
Os animais infectados pela cepa Y do T. cruzi foram tratados com uma dose diária de Bz ou Itz por 3, 5, 7 e 10 dias. Para a avaliação do efeito do tratamento foram usados os seguintes parâmetros: (i) supressão da parasitemia; (ii) tempo para a reativação da parasitemia após o tratamento e os níveis de parasitemia; (iii) redução da mortalidade.
Isabel Mayer de Andrade Resultados
Foi observada relação entre o tempo de tratamento e a eficácia dos dois compostos (Tabela 1 ). Quando os animais foram tratados por 3 dias foi observada a supressão da parasitemia em 100% dos animais tratados com Bz e em 83% dos animais tratados com Itz (Figura 3A). Além disso, o tempo para a reativação da parasitemia foi menor e os níveis de parasitemia foram significativamente maiores nos animais tratados com Itz em relação aos tratados com Bz (p<0,05).
Tabela 1 – Número de doses para a supressão da parasitemia, tempo para a reativação da parasitemia e mortalidade detectados em camundongos inoculados com 5x103 tripomastigotas sanguíneos da cepa Y do T. cruzi e tratados com 100mg/kg de peso (mpk) de Benznidazol ou Itraconazol por 3, 5, 7 ou 10 dias. Tempo de tratamento N° de doses para a supressão da parasitemia
Reativação da parasitemia após o tratamento
Mortalidade Reativação
% Dias Nível de parasitemia
3 dias/Bz 1,0 + 0 6/6 (100%) 7,5 + 3,98 9166 + 6645 0/6 3 dias/Itz 1,8 + 0,89* 6/6 (100%) 4,16 + 3,31 80833 + 163811** 1/6 5 dias/Bz 1,0 + 0 5/6 (83.3%) 15,66 + 8,43 58333 + 123396** 1/6 5 dias/Itz 1,83 + 0,4 4/6 (66.7%) 13,0+ 13,14 125.833 + 288849** 2/6 7 dias/Bz 1,0 + 0 3/6 (50%) 15,83 + 9,28 3333 + 4082 1/6 7 dias/Itz 1,5 + 0,54 4/6 (66.7%) 12,66 + 10,17 15000 + 22360 1/6 10 dias/Bz 1,0 + 0 4/6 (66.7%) 17,16 + 6,88 15333 + 12801 0/6 10 dias/Itz 1,67 + 1,21 5/6 (83.3%) 14,16 + 8,70 7500 + 5244 0/6 *Em um dos camundongos a parasitemia não foi suprimida
**Um camundongo apresentou parasitemia muito maior que os demais.
Nos animais tratados por 5 dias foi observado que as duas drogas induziram efeito semelhante em relação a supressão da parasitemia e redução da mortalidade, entretanto os níveis de parasitemia detectados após o término do tratamento foram significativamente maiores nos animais que receberam o Itz, em relação aos tratados com Bz (Tabela 1, Figura 3B).
Por outro lado, nos tratamentos realizados por 7 e 10 dias os resultados de todos os parâmetros analisados foram semelhantes entre os animais tratados com os dois compostos, mostrando que estes esquemas de tratamento seriam adequados para
detectar a atividade tripanocida de compostos com nível de atividade similar tanto ao Bz quanto ao Itz (Tabela 1 e Figura 3C e D).
0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 10 20 30 30 530 1030 1530 2030 2530 D 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 10 20 30 30 530 1030 1530 2030 2530 A 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 10 20 30 30 530 1030 1530 2030 2530 B 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 10 20 30 30 530 1030 1530 2030 2530 C