pAO815 PAOX1 HIS4 Intracelular Apresenta múltiplas cópias
pHIL-D2 PAOX1 HIS4 Intracelular Substituição do geneAOX1
pPIC3K PAOX1 HIS4 e kan r Intracelular MCS: seleção de múltiplas cópias por resistência a G418.
pPICZ PAOX1 ble r Intracelular MCS: seleção de múltiplas cópias por resistência a Zeocina ®
. Presença da cauda de histidina e do epítoto myc.
pHWO10 PGAP HIS4 Intracelular Promotor constitutivo PGAP.
pGAPZ PGAP ble r Intracelular
Promotor constitutivo, PGAP. MCS: seleção de múltiplas cópias por
resistência a Zeocina®. Presença da cauda de histidina e do epítoto myc.
pHIL-S1 PAOX1 HIS4 Extracelular Sinal de secreção PHO1
pPIC9K PAOX1 HIS4 e kan r Extracelular Sinal de secreção fator α de S. cerevisiae.
pPICZα PAOX1 HIS4 e kan r Extracelular
Sinal de secreção fator α de S. cerevisiae. MCS: seleção de múltiplas cópias por resistência a Zeocina®. Presença da cauda de
histidina e do epítoto myc.
pGAPZα PGAP ble r Extracelular
Promotor constitutivo PGAP. Sinal de secreção fator α de S.
cerevisiae. MCS: seleção de múltiplas cópias por resistência a Zeocina®. Presença da cauda de histidina e do epítoto myc.
FONTE: Adaptado de Higgins, Cregg (1998).
Legenda: MCS ⇒ Sítio múltiplo para clonagem; HIS4 ⇒ gene da histidinol desidrogenase. ble r ⇒ resistência a Zeocina®.
FIGURA 01 - Fórmula estrutural do antibiótico Zeocina®. Um glicopolipeptídeo básico, complexado ao íon cobre, solúvel em água e isolado de Streptomyces verticillus. Sua fórmula molecular é C55H83N19O21S2Cu e possui massa
molecular de 1.535 g.mol-1. FONTE: Berdy (1980).
A secreção de proteínas heterólogas em levedura é geralmente desejável quer do ponto de vista celular (uma vez que evita uma potencial toxicidade da proteína acumulada intracelularmente), quer do ponto de vista tecnológico, uma vez que simplifica significativamente os procedimentos de purificação do produto. A seqüência sinal mais utilizada é a pre-pro-leader do fator α da S. cerevisiae, contudo é possível usar a seqüência do gene que codifica a fosfatase ácida de P. pastoris. A seqüência pre-pro-leader do fator α é constituída por 19 resíduos de aminoácidos e a seqüência pro-leader por 66 resíduos. Nesta última seqüência existem três locais de consenso para N-glicosilação e um local de corte para a endoprotease Kex2 da S. cerevisiae. Ao contrário do que acontece na S. cerevisiae, em P. pastoris a proteína secretada encontra-se completamente processada e não hiperglicosilada (HIGGINS
et al., 1998). Em 2000, Kjeldsen et al. descreveram diferentes seqüências sinal que melhoraram o processo de secreção da insulina humana em P. pastoris.
Produção Het eróloga de Frut alina em Pichia past oris. FELI X, W. P.
Os sistemas de expressão heteróloga em P. pastoris também permitem produzir proteínas com cauda de poli-histidinas e com o epítopo myc, para purificação por cromatografia de afinidade em coluna imobilizada com níquel e detecção por western blot, respectivamente (DALY; HEARN, 2005).
Tipicamente a expressão de genes não pertencentes a P. pastoris é controlada firmemente pelo gene da álcool oxidase (AOX1), que é induzido pelo metanol mas reprimido quando as células passam a ter glucose ou glicerol como fonte de carbono. Inicialmente as células são crescidas em altas concentrações de glicerol e a produção da proteína heteróloga só começa quando a fonte de carbono é substituída por metanol (KIM et al., 2005). A via metabólica do metanol começa com sua oxidação a formaldeído, com produção de peróxido de hidrogênio pela enzima álcool oxidase. Para evitar a toxicidade deste metabólito, esta primeira reação ocorre no peroxissomo. A enzima álcool oxidase tem baixa afinidade pelo O2, sendo por isso
sintetizada em grande quantidade pelas células. Contudo, quando as células crescem em meios com glucose ou glicerol os níveis de mRNA destes genes não são detectados (CEREGHINO; CREGG, 2000). Embora existam dois genes que codificam a enzima álcool oxidase, AOX1 e AOX2, o gene mais transcrito, quando as células têm como única fonte de carbono o metanol, é o AOX1, conseqüentemente, é o promotor deste que é usado para expressão de genes heterólogos (MATTANOVICH
et al., 2004).
Embora o promotor AOX1 seja forte, verifica-se que a produção da proteína pode aumentar significativamente quando se faz a expressão em reator em pequena escala, por ser possível controlar as condições da fermentação. Em condições controladas de pH, temperatura e concentração de O2 é possível obter
altas densidades celulares, e deste modo aumentar a quantidade de proteína secretada. É também possível controlar os níveis de transcrição quando o promotor é o AOX1, porque a expressão do gene pode aumentar de três a cinco vezes se as células crescerem com limitação de metanol (CUNHA et al., 2004).
1.5 – Produção de Lectinas Recombinante em Pichia pastoris.
Apesar dos estudos sobre a produção de lectinas recombinantes em P. pastoris serem recentes, várias lectinas já foram expressas por esse sistema. Desde lectinas de fungos (AMANO et al, 2003), de vegetais (RAEMAEKERS et al., 1999) e até lectina de veneno de cobra (HU et al., 2005)
Como exemplos de lectinas vegetais já expressas em P. pastoris, podemos citar a GNA, de Galantus nivalis e a PHA, de Phaseolus vulgaris (RAEMAEKERS et al, 1999; BAUMGARTNER et al, 2003). Carvalho (2004) clonou e expressou, em P. pastoris, quatro diferentes construções da lectina de Canavalia brasiliensis (ConBr): dois tipos de precursores pro-ConBr, a pré-ConBr e o fragmento gama, porém a levedura não foi capaz de expressar corretamente a pro-ConBr. Rocha (2005) expressou a pro-ConBr em P. pastoris e avaliou sua capacidade de processamento e também estabeleceu uma metodologia para a lise celular de P. pastoris. Os resultados sugerem que a pro-ConBr expressa parece não ter sofrido processamento pós-traducional já que a proteína recombinante interage, após a lise celular, com os resíduos celulares via sítio de ligação a carboidratos, formando complexos de alto peso molecular que precipitam após centrifugação. Bezerra et al., (2006) expressaram a pré-pro-ConBr em P. pastoris.
Lannoo e colaboradores (2007), por sua vez, expressaram a lectina de
Nicotiana tabacum em P. pastoris com um rendimento de 6 mg de proteína recombinante por litro de meio de cultura após 72 h de cultivo.
Produção Het eróloga de Frut alina em Pichia past oris. FELI X, W. P.