Viabilidade de Agaricus subrufescens

A Tabela 2.2 apresenta a média dos discos viáveis (%) referentes aos diferentes tratamentos ao longo de 12 meses para a preservação em BDA com carvão ativo (A), BDA com óleo mineral (B) e até o 10º mês para o tratamento de discos em água (C), analisados a cada dois meses.

Tabela 2.2 - Média do número dos discos viáveis (%) submetidos aos diferentes métodos de preservação de Agaricus subrufescens em tubos contendo meio BDA com carvão ativo (A), BDA com óleo mineral (B) e água (C).

Método de Preservação

Média do número de discos viáveis (%)

Mês 2 Mês 4 Mês 6 Mês 8 Mês 10 Mês 12

A 75,00 75,00 68,75 75,00 93,75 75,00 B 87,50 87,50 75,00 62,50 62,50 50,00 C 93,75 100,00 100,00 75,00 50,00 0

Os métodos de preservação A e B permitiram que as frações se mantivessem viáveis por períodos mais longos, ou seja, até 12 meses, sendo que a viabilidade no início e no final do período estudado se manteve em 75 % para o método de preservação A, enquanto o método B conduziu a redução de viabilidade de 87,5 para 50 %. O método C se diferenciou do restante por apresentar viabilidade elevada até o sexto mês, após o qual se observou uma redução até 50 % no mês 10, e finalmente perda total de viabilidade no 12° mês.

O tratamento A, com carvão ativo, demonstrou ser a melhor opção para a preservação do fungo por um período de até 12 meses. Já o tratamento B, a base de óleo mineral não é recomendável devido à dificuldade de manuseio pela presença de grande quantidade de óleo mineral, fato que também dificulta o crescimento miceliano após transferência.

O carvão ativo é uma alternativa de preservação eficiente sendo que a presença do adsorvente pode estar associada a um processo de detoxificação dos metabólitos secundários que o fungo produz no substrato mesmo quando em condições de hipobiose. Isso se manifesta devido as baixas velocidades de crescimento do fungo exposto às baixas temperaturas (8 ºC) de estocagem. Vale salientar que de A. subrufescens cultivada no Brasil é incapaz de sobreviver em temperaturas abaixo de 4 °C (WASSER et al., 2002). Compostos tóxicos podem comprometer a viabilidade dos microrganismos. Dessa forma, o carvão ativo é adicionado ao meio com finalidade de remoção desses compostos dos meios de cultura obtidos por hidrólise de resíduos agroindustriais (CHANDEL et al., 2007; MUSSATTO; ROBERTO, 2001). O carvão ativo pode ser, portanto, uma alternativa importante também na produção de meios de cultura para a preservação de alguns fungos, como analisado por Duarte Filho et al. (2008) para os fungos micorrízicos.

Bruhn (1989), que reportaram um período de armazenamento de até 48 meses a 5 ºC, para algumas espécies de fungos micorrízicos, e um período de até 9 meses para outras espécies. Smith, Mckay e Molina (1994) também averiguaram viabilidade para 95 % dos 169 fungos testados depois de 20 meses de armazenamento, sendo a temperatura de armazenamento mais eficiente dependente da espécie.

Segundo Croan, Burdsall Jr. e Rentmeester (1999), a liofilização utilizando-se trealose 10% e lactose 10% pode ser aplicada para preservar diversos fungos. No entanto, A. subrufescens não sobreviveu quando foi submetido a essa técnica.

2.3.2 Velocidade de crescimento radial do micélio

A Figura 2.1 apresenta a média das velocidades de crescimento no 4º, 8º e 12º mês para os métodos de preservação A e B, e 4º e 8º mês para o tratamento C. A velocidade de crescimento radial do micélio de

A. subrufescens diminuiu em função do tempo de armazenamento

(período de 12 meses).

A velocidade de crescimento radial do fungo antes de ser preservado (tempo 0), apresentou uma média de 4,7 e 5,5 mm.d-1, em meio BDA e BDA com adição de carvão ativo, respectivamente. As Figuras 2.1A e 2.1B são similares, pois apresentam curvas polinomiais descendentes de crescimento radial até o 12° mês para o tratamento A e B, com velocidades de crescimento de 2,6 e 2,2 mm.d-1, respectivamente, em meio com carvão ativo. Para o tratamento C, apresentado na Figura 2.1C, houve uma diminuição brusca da velocidade de crescimento já no 8° mês de armazenamento.

Figura 2.1 – Velocidades médias de crescimento radial do fungo Agaricus subrufescens no 0, 4º, 8º e 12º meses para o método de preservação em tubos contendo meio BDA com carvão ativo (A), BDA com óleo mineral (B) e discos em água (C); comparativamente na recuperação em meio BDA ou BDA com carvão ativo. Tempo 0 refere-se à média das velocidades de crescimento do fungo antes do armazenamento. O gráfico D apresenta a média das velocidades para os três métodos em meio BDA com carvão ativo.

Mesmo que a velocidade de crescimento tenha uma diminuição ao longo dos meses, o meio BDA com adição de carvão ativo foi a forma de recuperação mais eficiente para todos os métodos de preservação. Devido a esse fato, a Figura 2.1D compara os diferentes métodos, considerando as bandas de confiança para as respectivas equações da reta. Não houve diferença significativa entre os tratamentos A e B, porém esses tratamentos foram significativamente diferentes dos valores do tratamento C. Entretanto, quando se consideram os dois tratamentos A e B, pode-se evidenciar uma tendência para um melhor desempenho do tratamento A que também contém carvão ativo para a preservação.

latência para o crescimento fúngico, ou seja, a fase lag, tendo sido verificado um maior tempo para o início do crescimento ao redor do disco, possivelmente devido à maior dificuldade do fungo se adaptar as novas condições ambientais ou relacionadas ainda à toxicidade da agaritina produzida pelo fungo no meio de cultivo (KONDO et al., 2006; MARÍN et al., 2008). Para esse experimento, essa fase foi desconsiderada ao aguardar-se o crescimento inicial do fungo no disco para posterior transferência para a placa a ser analisada a velocidade de crescimento radial. Mesmo desconsiderando essa fase, a velocidade foi menor conforme o aumento do tempo de preservação, e dependente do meio de cultura utilizado.

O fungo recuperado e inoculado em meio de cultura BDA apresentou sectorização, porém, quando inoculado em meio BDA com carvão ativo, o fungo apresentou suas características morfológicas padrão, com formação de colônia radial equidistante (Figura 2.2). Outras características descritas por Wasser et al. (2002) também foram constatadas, como a coloração branca da colônia, amarronzada no centro com possibilidade de exsudato amarelo, micélio denso, algodonoso, zoneado e aéreo.

Figura 2.2 - Crescimento do Agaricus subrufescens em meio de cultura BDA (direita) e BDA com adição de carvão ativo (esquerda) no 14°dia de cultivo.

Por outro lado, Mantovani, Linde e Colauto (2007) quando avaliaram o crescimento miceliano de A. subrufescens cultivado em placas utilizando diferentes fontes de nitrogênio, comparando com o controle positivo em meio de cultura contendo extrato de malte, não encontraram degenerações visíveis da colônia.

2.3.3 Análise da estabilidade genética de Agaricus subrufescens por