Voltametria Cíclica

A voltametria cíclica é uma técnica eletroquímica utilizada na investigação de processos de oxidação e redução em diferentes compostos e também no estudo de reações onde ocorre transferência de elétrons. (ELGRISHI et al., 2018).

O equilíbrio entre os pares de oxi-redução é dado pela equação de Nernst, que relaciona o potencial da célula (E) ao potencial padrão (E0_{) das espécies e a atividade}

do par de oxi-redução, onde F é a constante de Faraday, n o número de elétrons envolvidos na reação, R a constante universal dos gases e T a temperatura. A equação de Nernst (Equação 1) descreve como um sistema responde à mudança na concentração das espécies em solução ou à mudança no potencial do eletrodo (ELGRISHI et al., 2018).

𝐸 = 𝐸0 ₊𝑅𝑇

𝑛𝐹 ln (𝑂𝑥)

(𝑅𝑒𝑑) (1)

Os picos que aparecem no voltamograma estão relacionados às concentrações das diferentes espécies em solução e na superfície do eletrodo, e em como essas espécies se movem entre a superfície do eletrodo e a solução de acordo com o potencial aplicado. Se o processo de redução é reversível, a diferença entre o potencial dos picos catódico e anódico (ΔEp) é de 57 mV à 25 °C. Quando a

transferência de elétrons na superfície do eletrodo é devagar se comparado ao transporte de massa, este processo é irreversível eletroquimicamente. Isto é observado em um voltamograma por um ΔEp maior que 57 mV. Um processo

quimicamente reversível é aquele onde o analito pode ser reduzido e então reoxidado, se mantendo estável (ELGRISHI et al., 2018).

Como forma de estudar qualitativamente a ativação de O2 pelo complexo LCu, foi

realizada a análise por voltametria cíclica do complexo em ausência e presença de oxigênio na solução. Na Figura 13 é possível observar os voltamogramas obtidos.

Figura 13 – Voltamogramas Cíclicos obtidos para o complexo CuL em atmosfera de nitrogênio

(vermelho),e em atmosfera de O2 (preto) na faixa de potencial -1,5 V à 1,5 V, em solução de TBAPF6

0,1 mol L-1 _{em DMSO com velocidade de varredura: de 100 mV, carbono vítreo:calomelano:platina:}

Baseado nos resultados reportados por Santos (2017) as bandas presentes no voltamograma obtido em atmosfera de N2, apresentado na Figura 12, podem ser

atribuídas como sendo a oxidação do grupo álcool livre na região anódica (+ 1,19 V vs. calomelano). Na varredura inversa, dois picos são observados, possivelmente, referentes aos processos redox Cu(II)/Cu(I) em - 0,78 V vs. calomelano e Cu(I)/ Cu(0) em – 1,15 V vs. calomelano (SARGENTELLI et al., 1997).

Já em atmosfera de O2 o sinal atribuído à oxidação do grupo álcool livre se

mantém inalterado. Entretanto, na região catódica observa-se apenas o sinal referente ao processo Cu(II)/Cu(I) em - 0,75 V, com um aumento na corrente. Isto sugere que o complexo pode ser capaz de catalisar a eletroredução de O2 (SANTOS, 2017).

4.2. Avaliação da atividade de catecolase 4.2.1. Estudo do efeito de pH

A oxidação do 3,5-di-terc-butilcatecol (3,5-DTBC) a sua respectiva 3,5-di-terc-butil- o-benzoquinona (3,5-DTBQ), catalisada pelo complexo LCu foi utilizada como reação modelo para a determinação do pH ótimo de reação. A Figura 14 apresenta o gráfico de velocidade inicial (V0) x pH obtido para o complexo.

Figura 14 - Dependência da velocidade inicial da reação do 3,5-DTBC com o pH para o complexo LCu. Condições: [C]final ≈ 6,57 x 10-5 mol L-1, [T]final ≈ 3,03 x 10-1 mol L-1, [S]final ≈ 1,01 x 10-2 mol L-1.

Pode-se observar que em pHs próximos a 6 a atividade é bastante baixa e tem um aumento significativo a partir de 8,5. O perfil da curva não permite determinar a velocidade máxima, uma vez que não foi observado um perfil de saturação nas condições do experimento. Entretanto, os experimentos de variação de concentração do substrato foram medidos em pH 10 para uma direta comparação com outros complexos descritos na literatura.

4.2.2. Estudo do efeito da concentração de substrato

Com o objetivo de determinar os parâmetros cinéticos da reação de oxidação do 3,5-DTBC catalisada pelo complexo LCu, foi realizada a análise do efeito da concentração do substrato 3,5-DTBC sobre a velocidade da reação modelo. Os parâmetros cinéticos foram obtidos utilizando o modelo de Michaelis-Menten, assim como ajuste linear de Lineweaver-Burk. Na figura 15 é observada a influência da concentração de substrato na velocidade inicial de reação com o ajuste não-linear por mínimos quadrados da equação de Michaelis-Menten.

Figura 15 - Dependência da velocidade da reação do 3,5-DTBC com a variação da concentração de substrato para o complexo LCu. Condições: [C]final ≈ 9,5 x10-5 mol L-1, [T]final ≈ 3,03 x 10-1 mol L-1

[CHES, pH 10], [S]final ≈ 5,45 x 10-4 – 7,63 x 10-3 mol L-1.

Na figura 16 é observada a influência da concentração de substrato na velocidade inicial de reação com o ajuste linear de de Lineweaver-Burk.

Figura 16 - Dependência da velocidade da reação do 3,5-DTBC com a variação da concentração de

substrato para o complexo LCu com ajuste linear de Lineweaver-Burk. Condições: [C]final ≈ 9,5 x10-5

mol L-1_{, [T]}

final ≈ 3,03 x 10-1 mol L-1 [CHES, pH 10], [S]final ≈ 5,45 x 10-4 – 7,63 x 10-3 mol L-1.

Os parâmetros cinéticos obtidos pelo ajuste não linear por mínimos quadrados da equação de Michaelis-Menten e pelo ajuste linear de Lineweaver-Burk estão condensados na Tabela 4.

Tabela 4 - Parâmetros cinéticos preliminares obtidos pelo ajuste não linear por mínimos quadrados da equação de Michaelis-Menten e pelo ajuste linear de Lineweaver-Burk

Michaelis-Menten Lineweaver-Burk Vmax (mol.L-1_.s-1_{) x 10}-6 _{1,68 ± 0,37 1,47 ± 4,00} KM (mol.L-1_{) x 10}-3 _{4,79 ± 2,15 4,37 ± 1,29} kcat (s-1_{) x 10}-4 _{1,00 0,88} Kass (mol-1_{.L) 209 229} kcat/Km (L.mol-1_.s-1_{) x 10}-2 _{2,1 2}

A constante de Michaelis-Menten Km é uma propriedade de cada enzima ou

biomimético. Ela pode ser entendida como um combinado de constantes cinéticas relacionada a formação do complexo ES e em sua subsequente decomposição para a produção do substrato. Em reações com vários substratos, esta constante se relaciona com as várias constantes cinéticas envolvidas (ROSKOSKI, 2014). Tal constante também está relacionada com a estabilidade do complexo ES. Quanto menor este valor, mais estável é o complexo (LEHNINGER; NELSON; COX, 2008).

A Kass está relacionada a força da ligação do complexo enzima-substrato.

Quanto maior este valor, mais favorável é a formação deste complexo. O ciclo catalítico é representado pelo valor de kcat, significando o número de moles de

substrato processados por unidade de tempo por mol de enzima, ou número de turnovers. A razão kcat/Km indica a eficiência catalítica (LEHNINGER; NELSON; COX,

2008).

Na Tabela 5 são mostrados os valores obtidos neste trabalho, comparados a diferentes complexos de Cu+2 _{reportados nos últimos anos. Na figura 17 é mostrada}

a estrutura dos complexos na tabela 5.

Tabela 5 – Parâmetros cinéticos da oxidação do 3,5-DTBC catalisado por complexos reportados nos últimos anos

Complexo Vmax (mol.L-1_.s-1₎ x 10-6 KM (mol.L-1₎ x 10-3 kcat (s-1₎ x 10-2 kcat/Km (L.mol-1_.s-1₎ LCu 1,68 ± 0,37 4,79 ± 2,15 0,01 0,021 1 0,05 2,6 0,006 0,023 2 0,24 5,04 0,47 0,93 3 0,62 3,47 2,5 7,20

Figura 17 - Estrutura dos complexos na tabela 5. (1) (PANDA et al., 2011) (2) (PATRA et al., 2013) (3) (CASTRO et al., 2016)

O complexo LCu estudado neste trabalho apresentou o menor valor de eficiência catalítica entre os complexos avaliados, apesar dos valores de Vmáx e Km

obtidos se encontrarem de acordo com valores listados na literatura.

Complexos binucleares de cobre apresentam, em geral, atividade superior a complexos mononucleares. Na literatura, diversos autores atestam até que complexos mononucleares apresentam pouca, se não nenhuma atividade catalítica na oxidação de catecóis (ROCHA et al., 2016). Uma possível explicação para a baixa eficiência pode se dar pelo fato do complexo estudado ser mononuclear e, em seu mecanismo, necessitar formar em solução um dímero com outra molécula do complexo para ser ativo.

Uma outra possível razão para a pequena atividade catalítica apresentada pelo complexo é a reatividade dele com a molécula de O2. Os mecanismos propostos para

a atividade de catecolase envolvem a geração de um intermediário contendo O2. As

medidas de voltametria cíclica mostram que o complexo é capaz de catalisar a reação de redução do oxigênio e, portanto, este intermediário não seria facilmente estabilizado.