WESTERN BLOT

As proteínas foram transferidas do Gel de Poliacrilamida para uma Membrana de Nitrocelulose utilizando-se sistema de imunotransferência com 0,8 mA/cm2 Gel/Membrana de Nitrocelulose, por 1 hora, utilizando-se Tampão Tris-Glycina 20% MeOH. A membrana foi armazenada em tampão Tris/NaCl pH 7,5, em refrigerador, quando a revelação seria realizada no dia seguinte.

Método Imunoquímico

Por este método, as proteínas separadas no gel de poliacrilamida foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose, sobre a qual procedeu-se as reações imunoquímicas.

Um primeiro anticorpo (no caso contra asparaginase), quando identifica uma seqüência de aminoácidos comuns (determinante antigênico), reage com a proteína, e, ao final do processo, temos resultados positivos (precipitação do produto da reação catalisada pela enzima conjugada com o segundo anticorpo). Na ausência de determinante antigênico identificável pelo anticorpo, não ocorre precipitação. O método identifica a existência de proteína com seqüência de aminoácidos comuns.

Tampões: TBS pH 7,5 (Tris/NaCl) TBS pH 9,5 (Tris/NaCl/ MgCl2) 6,05 g Tris 2,9 g NaCl 508 mg MgCl2 TBS pH 7,5/0,1% TWWEN 20 TBS pH 9,5/0,1% TWWEN 20 TRIS-GLYCINA 20% MeOH

APÓS A TRANSFERÊNCIA:

1. A membrana foi imersa em TBS pH 7,5 a 4°C, à noite, quando o processo foi interrompido para que se continuasse no dia seguinte;

2. A membrana foi imersa em TBS pH 7,5/3% leite em pó desnatado (100 ml) por 1 hora;

3. Em seguida, lavou-se em TBS pH 7,5/TWWEN 20 , 3 vezes de 10 minutos;

4. A membrana foi imersa em solução de anticorpo de coelho anti-asparaginase diluído (1:500 - 1:1000) em TBS pH 7,5/TWWEN 20 por 2 horas;

5. Lavou-ser em TBS pH 7,5/TWWEN 20, 3 vezes de 10 minutos;

6. A membrana foi imersa em solução do anticorpo de cabra anti-coelho conjugado com fosfatase (comercial) diluído em TBS pH 9,5/TWWEN 20 por 1 hora;

7. Lavou-se em TBS pH 9,5/ TWWEN 20, 3 vezes de 10 minutos;

8. Incubou-se em solução com NBT/BCIP/TBS pH 9,5 por alguns minutos, até que aparecessem as bandas.

Após a revelação, a membrana foi armazenada em H2O destilada, para

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

No presente experimento, conduzido em hidroponia, as plantas referentes aos tratamentos T1 e T2 (recebendo concentrações diferentes de nitrato em solução) desenvolveram-se normalmente, atingindo fase reprodutiva; no entanto, as plantas recebendo solução nutritiva sem nitrogênio, inoculadas com Bradyrhizobium sp., não apresentaram nodulação satisfatória, prejudicando seu desenvolvimento e não chegando a atingir a fase reprodutiva. Os dados referentes à T3, então, referem-se a plantas em deficiência de nitrogênio e os estádios referentes a início de florescimento (E2) e início de formação de frutos (E3), para este tratamento, correspondem a estádio vegetativo.

4.1 Quantificação de compostos nitrogenados

Tabela 1. Quantificação de compostos nitrogenados em sementes maduras e tecidos de plantas jovens (7 dias após germinação). Os valores são referentes à média de três repetições. Tecido Aminoácidos (micromoles/ g de tecido fresco) Proteína (mg/ g de tecido fresco) Nitrat o (micromoles/ g de tecido fresco) Alantoína (nanomoles/ g de tecido fresco) Ácido Alantóico (nanomoles/ g de tecido fresco) Semente 48,64 5,70 0 760,81 55,21 Folha 2,15 4,84 0 7,26 33,55 Cotilédone 4,44 24,99 0,71 58,49 61,23 Caule 5,19 3,09 0,20 158,50 62,57 Raiz 2,81 4,09 0 29,13 27,33

Os dados apresentados na Tabela 1 referem-se a semente e plantas jovens, em estádio primário de desenvolvimento, ou seja, indicam apenas remobilização e translocação de reservas. Pelos dados exibidos, sugere-se que a espécie armazena grandes quantidades de aminoácidos e que, aos 7 dias de desenvolvimento, ainda possui grandes reservas a nível cotiledonar, o mesmo não se aplicando aos dados de quantificação de proteína total. Em relação a proteína total, observou-se que a espécie não armazena reservas predominantemente nesta forma, sendo que nas fases iniciais de desenvolvimento, que compreendem o primeiro período após a germinação, a espécie demonstrou sintetizar altas quantidades de proteína, o que pode ser observado pelos dados referentes a cotilédone. Inversamente a estes dados, os resultados obtidos para aminoácidos solúveis totais demonstram que há uma forte redução nestes níveis nas

fases iniciais de desenvolvimento, o que provavelmente está relacionado ao aumento nos níveis de proteína.

Com relação ao nitrato, a espécie não armazena nitrogênio nesta forma, o que era esperado, sendo que os valores observados para cotilédone e caule, próximos a zero, podem estar relacionados ao limite de sensibilidade do método. A espécie demonstra armazenar grande quantidade de nitrogênio metabolizado sob forma de ureídeos, principalmente alantoína, o que pode ser observado pelos dados obtidos para quantificação de ureídeos em sementes, sendo que os valores observados para sementes são superiores aos relatados para tecidos de soja (Atkins et al., 1992) e os observados para tecidos de plantas jovens, aos 7 dias após a germinação, são inferiores aos descritos na literatura para tecidos de plantas (Atkins et al., 1992; Herridge et al., 1996).

Pelos resultados obtidos para os primeiros estádios de desenvolvimento das plantas, observou-se que aos 7 dias após a germinação a translocação de nitrogênio metabolizado sob a forma de ureídeos, especialmente alantoína, é elevada, o que pode ser confirmado pelos dados de concentração em caule. A utilização de ureídeos como metabólito de reserva já havia sido observada em algumas espécies, sendo que Peoples et al. (1991) relatou que ureídeos também são utilizados como compostos de reserva em diversas espécies, tendo sido detectados em seiva de xilema de plantas jovens, em estádio primário de desenvolvimento, sendo portando resultado da translocação de reservas.

Tabela 2. Quantificação de compostos nitrogenados em tecidos de plantas (E1= Estádio vegetativo). Os valores são referentes à média de três repetições. Médias assinaladas com letras diferentes entre tratamentos são diferentes a nível de 5% pelo teste de Tukey.

Tratamento Aminoácidos (micromoles/g de tecido fresco) Proteína (mg/ g de tecido fresco) Nitrato (micromoles/g de tecido fresco) Alantoína (nanomoles/ g de tecido fresco) Ácido Alantóico (nanomoles/ g de tecido fresco) Folhas 15 mM NO3- 17,96 A 3,95 A 28,32 A 17,61 AB 22,98 AB 7,5 mM NO3- 15,73 A 0,93 AB 12,87AB 15,73 B 35,02 A - N 6,11B 0,37B 2,42B 29,34 A 17,69 B Caule 15 mM NO3- 22,18B 0,48 A 20,45 AB 48,83 A 5,76 A 7,5 mM NO3- 41,12 A 0,17 AB 88,04 A 49,49 A 0 B - N 19,55 B 0,07 B 0,09 B 40,45 A 0 B Raiz 15 mM NO3- 27,9 A 0,57 A 31,17 AB 60,73 B 15,02 A 7,5 mM NO3- 31,37 A 0,26 AB 47,28 A 84,34 A 0 B - N 10,51 B 0,07 B 0,00 B 57,39 B 0 B

Pelos dados apresentados na Tabela 2, observou-se que em estádio vegetativo (E1), os tratamentos T1 e T2 não apresentaram diferenças significativas nas concentrações de aminoácidos totais, mas diferiram significativamente para as concentrações de alantoína e ácido alantóico, em tecidos foliares. As concentrações de alantoína em folhas foram mais expressivas no tratamento T3, ocorrendo o inverso em relação a ácido alantóico. Os valores aqui observados são coerentes com os relatados por Herridge et al. (1996) para Desmodium rensonii, em experimento suprido com nitrato.

Observou-se que as variações na concentração de nitrogênio fornecido alterou a concentração de proteína total e nitrato em folhas, sendo que a gradação de nitrato fornecida foi respectivamente igual às concentrações de proteína e nitrato solúvel encontradas em folhas, ou seja, T1 apresentou maiores concentrações, seguido por T2 e

este por T3. Os níveis de nitrato observados para o tratamento T3, próximos a zero, podem estar relacionados ao limite de sensibilidade do método, não indicando provavelmente a presença de nitrato nos tecidos, para este tratamento.

Para o mesmo estádio de desenvolvimento, observou-se diferenças significativas na concentração de nitrato em caule, de forma que T1 apresentou concentração reduzida, em relação a T2; no entanto o inverso foi observado para a concentração de proteína total e ácido alantóico. O mesmo ocorre quando se observa as amostras referentes a tecidos de raiz. As concentrações de ureídeos observadas para os tecidos, no três tratamentos, para o estádio avaliado (E1, estádio vegetativo) foram inferiores aos relatados para tecidos de soja (Atkins et al., 1992) e próximos aos de algumas espécies avaliadas por Herridge et al. (1996) e por Gathumbi et al. (2002).

Em raiz, as concentrações de alantoína apresentaram diferenças entre os tratamentos T1 e T2, sendo que T2 apresentou maiores concentrações que T1, diferindo a 5% de significância. As concentrações totais de ureídeos (alantoína + ácido alantóico) observadas nos tecidos avaliados em estádio vegetativo, para os três tratamentos, foram coerentes com as relatadas por Rodriguez-Navarro et al. (1999) para plantas do gênero

Phaseolus recebendo solução nutritiva contendo nitrato, e inferiores aos relatados por

Peoples et al. (1991) para soja, onde obteve médias da ordem de 400 nanomoles de ureídeos por grama de tecido fresco em plantas não inoculadas, portanto não fixando nitrogênio simbioticamente; os valores aqui obtidos para Canavalia ensiformes (L.) variaram entre 40 nanomoles de ureídeos (folhas) a 60-80 nanomoles de ureídeos (raiz).

Tabela 3. Quantificação de compostos nitrogenados em tecidos de plantas (E2= Início de florescimento). Os valores são referentes à média de três repetições. Médias assinadas com letras diferentes entre tratamentos são diferentes a nível de 5% pelo teste de Tukey.

Tratamento Aminoácidos (micromoles/g de tecido fresco) Proteína (mg/ g de tecido fresco) Nitrato (micromoles/g de tecido fresco) Alantoína (nanomoles/ g de tecido fresco) Ácido Alantóico (nanomoles/ g de tecido fresco) Folhas 15 mM NO3- 20,14 A 0,73 A 19,02 A 364 A 247,58 A 7,5 mM NO3- 7,62 B 0,36 B 9,23 AB 294,3 A 241,42 A - N 1,41 B 0,29 B 0,97 B 50,5 B 188,36 B Caule 15 mM NO3- 11,96 A 0,53 A 35,75 A 462,1 A 63,62 B 7,5 mM NO3- 7,49 AB 0,48 A 9,57 AB 352,4 A 104,65 A - N 2,85 B 0,27 B 0,71 B 147,1 B 67,87 B Raiz 15 mM NO3- 13,51 A 1,25 A 91,67 A 281,5 A 275,87 A 7,5 mM NO3- 9,84 AB 0,37 B 9,38 AB 267,8 A 229,05 AB - N 0,71 B 0,21 B 0,87 B 89,6 B 108,13 B

Para as amostras coletadas em início de florescimento (E2, Tabela 3), observou-se alterações a nível quantitativo em relação ao total de aminoácidos solúveis, onde T1 apresentou aumento significativo em relação a T2, em tecidos foliares, sendo que a mesma variação ocorreu em relação à concentração de nitrato no tecido.

Neste estádio houve um incremento na concentração de alantoína e ácido alantóico, em folhas, para os três tratamentos em questão, em relação ao primeiro estádio de desenvolvimento estudado (estádio vegetativo, E1), o que foi relatado por Peoples et al. (1991), onde observou incremento nos níveis de ureídeos em função da mudança no estádio de desenvolvimento, ou seja, com o início de florescimento. Neste experimento T1 e T2 não diferiram significativamente entre si, mas diferiram de T3, quanto aos níveis de alantoína e ácido alantóico observados. O total de ureídeos

(alantoína + ácido alantóico) aqui observados foram similares aos relatados por Atkins et al. (1992) para tecidos de soja, em condições onde as plantas não estavam fixando nitrogênio simbioticamente.

Em relação aos níveis de proteína total, T1 difere dos demais tratamentos, apresentando maior concentração que T2 e T3, no entanto os níveis foram inferiores aos observados em E1, estádio vegetativo.

Em caule, houve variação na concentração de nitrato no tecido, sendo que T1 apresentou uma maior concentração em relação à T2, inversamente ao que foi observado para o primeiro estádio de desenvolvimento. Observou-se uma maior concentração de aminoácidos solúveis totais em T1, em relação a T2, mas os níveis de proteína total não diferiram entre estes dois tratamentos; T3 apresentou os menores níveis de aminoácidos solúveis e de proteína, o que pode estar relacionado à deficiência no suprimento de nitrogênio.

Em raiz, observou-se uma variação significativa na concentração de aminoácidos solúveis totais, entre os três tratamentos avaliados, sendo que T1 apresentou os maiores níveis e T3, os menores. Também foi observado variação nos níveis de proteína, sendo que T1 diferiu dos demais tratamentos e os tratamentos T2 e T3 não diferiram entre si. Em relação a nitrato, foi mantido o padrão observado em relação a folhas e caule, ou seja, T1 apresentou os maiores níveis de nitrato solúvel no tecido, seguido por T2; T3 apresentou baixas concentrações, o que era esperado pelo fato de o tratamento não estar recebendo nitrato em solução, sendo que os níveis de nitrato observados para T3, próximos a zero, podem estar relacionados ao nível de sensibilidade do método utilizado.

Para as análises de ureídeos em raiz, foi observado incremento nos níveis de alantoína e de ácido alantóico, quando comparado ao estádio vegetativo. Em relação a alantoína, T1 e T2 apresentaram as maiores concentrações, não diferindo entre si, mas diferindo de T3; já em relação a ácido alantóico, os incrementos foram mais expressivos, quando comparado às análises realizadas para estádio vegetativo (E1), já que em T1 as concentrações eram baixas, em relação aos níveis observados para alantoína, e os tratamentos T2 e T3 não apresentavam ácido alantóico em caule e raiz. Observou-se que

T1 apresentou os maiores níveis de ácido alantóico, em início de florescimento (E2), seguido por uma pequena diferença em relação a T2, ambos os tratamentos diferindo entre si, e T3 apresentou as menores concentrações deste ureídeo, em raiz. O aumento no nível de ureídeos em função do início do período reprodutivo (neste caso início de florescimento) foi relatado por Peoples et al. (1991), para plantas de soja.

Tabela 4. Quantificação de compostos nitrogenados em tecidos de plantas (E3= Início de formação de frutos). Os valores são referentes à média de três repetições. Médias assinaladas com letras diferentes entre tratamentos são diferentes a nível de 5% pelo teste de Tukey. Tratamento Aminoácidos (micromoles/g de tecido fresco) Proteína (mg/ g de tecido fresco) Nitrato (micromoles/g de tecido fresco) Alantoína (nanomoles/ g de tecido fresco) Ácido Alantóico (nanomoles/ g de tecido fresco) Folhas 15 mM NO3- 9,93 A 0,68 A 3,49 AB 216,5 AB 259,45 B 7,5 mM NO3- 6,97 AB 0,26 AB 5,27 A 159,6 B 553,21 A - N 2,10 B 0,19 B 0,84 B 394 A 435,82 AB Caule 15 mM NO3- 12,96 A 0,36 B 7,45 AB 151,1 B 226,44 A 7,5 mM NO3- 16,68 A 0,30 B 16,42 A 511,3 A 123,88 AB - N 4,78 B 0,63 A 0,97 B 521,1 A 79,84 B Raiz 15 mM NO3- 25,36 A 0,93 A 5,82 A 89,69 A 798,0 A 7,5 mM NO3- 13,42 AB 0,67 AB 5,37 A 95,63 A 662,8 B - N 4,06 B 0,46 B 0,99 B 11,51 B 706,4 AB

Em início de formação de frutos, E3 (Tabela 4), observou-se que, em folhas, T1 apresentou maior concentração de aminoácidos solúveis que T2, enquanto T3 apresentou as menores concentrações, o mesmo sendo observado em relação a proteína total. Em relação a nitrato, em folhas, T2 apresentou as maiores concentrações, seguido

de T1, sendo que todos diferiram entre si. Os níveis de ureídeos observados não apresentaram diferenças expressivas em relação ao início de florescimento (E2), sendo que T3 apresentou os maiores níveis de alantoína, seguido por T1, e T2 apresentou as menores concentrações, em tecidos foliares; já em relação a ácido alantóico, T2 apresenta as maiores concentrações, seguido por T3, sendo que T1 apresentou os menores níveis. Os valores encontrados para ureídeos em Canavalia ensiformes (L.) foram superiores aos relatados por Herridge et al. (1996), para diferentes espécies, e por Atkins et al. (1992) para plantas de soja.

Em caule, não observou-se diferenças significativas nas concentrações de aminoácidos solúveis entre os tratamentos T1 e T2, sendo que T3 apresentou as concentrações mais baixas. Para os níveis de proteína total, a relação foi inversa à observada em folhas, ou seja, T3 apresentou as concentrações mais elevadas, diferindo de T1 e T2, que por sua vez não diferiram entre si.

Em relação aos níveis de nitrato observados em caule, T2 apresentou as maiores concentrações, diferindo significativamente de T1, sendo que T3 apresentou baixas concentrações, o que era esperado pelo fato de o tratamento não receber nitrato em solução, sendo que as concentrações de nitrato observadas para T3, próximas a zero, podem estar relacionadas ao limite de sensibilidade do método, não se referindo, então, à presença de nitrato nos tecidos avaliados, para este tratamento. No que se refere a quantificação de ureídeos, T1 apresentou os menores níveis de alantoína e os maiores de ácidos alantóico; T2 e T3 não diferiram entre si para as concentrações de alantoína, mas T2 apresentou maiores concentrações que T3, para as amostras de caule, sendo os valores superiores aos relatados por Herridge et al. (1996) e por Atkins et al. (1992).

Em raiz, observou-se que T1 apresentou maiores concentrações de aminoácidos solúveis que T2, sendo que T3 apresentou as menores concentrações; o mesmo perfil foi observado em relação a proteína total, sendo que T2 e T3 apresentaram maiores concentrações que as observadas em início de florescimento (E2).

Em relação à concentração de nitrato, os níveis observados foram menores que nos demais tecidos, podendo esta redução estar relacionada à maior atividade de NR neste tecido (ver item 5.4, Tabela 24); a mesma redução observou-se

para os níveis de alantoína neste tecido, sendo que T3 apresentou as menores concentrações e os tratamentos T1 e T2 não diferiram entre si. Para os níveis de ácido alantóico, estes apresentaram-se maiores que nos demais tecidos, sendo que T1 apresentou as maiores concentrações, seguido por T3 e este por T2, de forma que todos os tratamentos diferiram significativamente entre si (5% de significância, teste Tukey).

Pelos dados da Tabela 5 (quantificação de ureídeos em seiva de xilema, estádios reprodutivos, E2 e E3) observou-se que em estádio reprodutivo (E2 e E3, início de florescimento e início de formação de frutos, respectivamente), as maiores concentrações de ureídeos translocados via xilema estão na forma de alantoína, sendo que, em E2, T1 apresentou maiores concentrações deste metabólito que T2, não havendo diferença significativa para os níveis de ácido alantóico. Já em E3, T2 demonstrou os maiores níveis de alantoína, enquanto T1 apresentou concentrações maiores de ácido alantóico, diferindo a 5% de significância (teste Tukey), sendo que os valores obtidos para seiva de xilema em Canavalia ensiformes (L.) mostraram-se similares aos observados por Herridge et al. (1996), para Desmodium rensonii, e por Peoples et al. (1991) e Atkins et al. (1992), para soja.

Observando-se os dados referentes a ureídeos para os tecidos de plantas, observou-se que em E2 (Tabela 3) as concentrações de alantoína foram maiores em folhas que em raízes, já as concentrações de ácido alantóico foram praticamente iguais nos dois tecidos, podendo esta diferença estar relacionada à concentração exportada via xilema neste estádio de desenvolvimento. A mesma relação se mantém em E3 (Tabela 4), onde observou-se que, em folhas, a concentração de ureídeos sob forma de alantoína foi mais elevada que em raízes, e, em relação a ácido alantóico, as concentrações em raízes foram maiores que nos demais tecidos, o que corrobora os resultados obtidos para seiva de xilema.

Para as análises referentes a seiva de xilema, o tratamento T3 não foi apresentado, uma vez que, por encontrar-se em deficiência nutricional, apresentava pouca parte aérea, o que impossibilitou a coleta de seiva por exudação.

Tabela 5. Quantificação de ureídeos em seiva de xilema (E2 e E3= Estádios reprodutivos). Os valores são referentes à média de três repetições. Médias assinaladas com letras diferentes entre tratamentos são diferentes a nível de 5% pelo teste de Tukey.

Tratamento Alantoína (nanomoles/ ml seiva) Ácido Alantóico (nanomoles/ ml seiva)

Estádio 2 (Início de florescimento)

15 mM NO3- 209,77 A 86,98 A

7,5 mM NO3- 119,87 B 70,93 A

Estádio 3 (Início de formação de frutos)

15 mM NO3- 66,0 B 50,81 A

4.2 Análise Qualitativa de Aminoácidos por Cromatografia Líquida de Alta Resolução (HPLC)

Tabela 6. Análise qualitativa de aminoácidos solúveis em sementes maduras.

Aminoácido Concentração ( nmol/ g semente) mol% Aminoácido Glutamato 160,6 2,74 Glicina 5436,19 92,90 Canavanina 55,54 0,95 Valina 199,29 3,41

Pelos dados da Tabela 6, observou-se que, em sementes maduras de

Canavalia ensiformes (L.), glicina é o aminoácido preponderante encontrado na forma

solúvel, perfazendo cerca de 93% do total de aminoácidos solúveis. Glutamato, canavanina e valina foram também observados, no entanto as concentrações foram insignificantes comparando-se aos resultados encontrados para glicina.

Em espécies do gênero Lens (Rozan, 2001), foi observado que em sementes maduras as concentrações de aminoácidos solúveis encontradas são baixas, sendo que asparagina, alanina, aspartato e glutamato são os aminoácidos preponderantes; neste caso glicina esteve presente em níveis da ordem de 5-10% do total de aminoácidos solúveis.

Tabela 7. Análise qualitativa de aminoácidos incorporados a proteínas em sementes maduras. A concentração é expressa em micromoles de aminoácidos/g semente; a % representa mol% de aminoácido.

Aminoácido Concentração % Aminoácido

Aspartato + Asparagina 471,85 7,12 Glutamato + Glutamina 1526,28 23,04 Serina 861,42 13,01 Histidina 681,72 10,29 Canavanina 381,89 5,77 Glicina 134,03 2,02 Treonina 504,17 7,61 Arginina 1045,22 15,78 Alanina 386,27 5,83 Metionina 22,72 0,34 Valina 14,37 0,22 Fenilalanina 27,55 0,42 Isoleucina 70,25 1,06 Leucina 27,50 0,42 Lisina 468,18 7,07

Quando analisou-se a composição protéica das sementes, observou-se que os aminoácidos predominantes foram glutamato + glutamina, seguidos por arginina e serina (23, 15,7 e 13%, respectivamente). Histidina e aspartato apresentaram valores significativos (10 e 7%, respectivamente), entretanto os níveis de canavanina observados foram baixos, 5,7%, a comparar com os aminoácidos predominantes, sugerindo que a principal forma de aminonitrogênio armazenada em Canavalia ensiformes (L.) possivelmente está na forma de glicina solúvel e glutamato e glutamina, na forma incorporada, e não canavanina.

Aos 7 dias após a germinação (Tabela 8), os níveis de canavanina observados são elevados, demonstrando papel importante na translocação de nitrogênio metabolizado, o que pode ser confirmado pelas altas concentrações presentes em caule, da ordem de 17%. Os níveis de canavanina observados em sementes maduras, 0,95% na forma solúvel e 5,7% na forma incorporada, não justificam as altas concentrações encontradas em plantas jovens (7 dias após a germinação), que chega à ordem de 57% em folhas, o que sugere que há síntese elevada deste aminoácido nos primeiros estádios de desenvolvimento, contradizendo as informações encontradas na literatura. Rosenthal (1992) relatou que os níveis de canavanina armazenados em sementes chega a constituir 13% do total de aminonitrogênio das sementes, em plantas que possuem este aminoácido