Efeito do AMA sobre os níveis de Malondealdeido

Os resultados da avaliação da peroxidação lipídica (Figura 30) dos animais com DA induzida, e tratados com o AMA, revelaram que este composto não foi capaz de proteger os lipídios do tecido cerebral de danos oxidativos, uma vez que os níveis de TBARS encontram-se significativamente equivalentes aos animais controle.

TBARS (µµµµm) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4

5 15 30

Tratamentos (mg/kg)

Controle Naive AMA

Figura 30: Determinação dos níveis de TBARS nos grupos de camundongos tratados com DA induzida por STZ e tratados com AMA (5, 15 e 30 mg/kg), grupos de animais controle negativo e grupo de animais Naive. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo.

6 DISCUSSÃO

A Rapanea ferruginea é uma planta medicinal pertencente a família Myrsinaceae e que possui ampla distribuição pelo território brasileiro, bem como diversas outras regiões da América do Sul. Esta espécie tem sido largamente estudada por pesquisadores da UNIVALI e têm apresentado efeitos farmacológicos promissores sobre o SNC (PEREIRA et al., 2004; GALVAN, 2007; ANTONIALLI, 2008; GAZONI, 2009; FILLIPIN, 2010)

A avaliação da R. ferruginea foi realizada através da preparação de um extrato diclorometano (ERF), e, o isolamento e identificação de substâncias foram oriundas desta extração, o que possibilitou a realização de testes farmacológicos e bioquímicos na busca de efeitos anti-Alzheimer.

A extração e isolamento de compostos naturais têm colaborado para o desenvolvimento de muitos fármacos que vêm sendo empregado no tratamento de diversas patologias. Um exemplo é o alcalóide Galantamina, isolada da Galanthus nivalis e de várias espécies da família Amaryllidaceae, que apresenta atividade anticolinesterásica e é utilizado no tratamento da DA desde 2001 (HEINRICH, 2010).

Para a separação e purificação de compostos do ERF procedeu-se realização de CC. Esta técnica cromatográfica utiliza uma fase estacionária, sílica gel, e uma fase móvel, caracterizada por uma mistura de solventes orgânicos. A CC é uma técnica bastante simples, de baixo custo, pouco material, e, que permite o isolamento de compostos naturais de extratos e frações complexas (CECHINEL- FILHO; YUNES, 1998; CAO et al., 2010).

Gazoni (2009) isolou diversas substâncias dos frutos, caules e folhas da R.

ferruginea utilizando esta mesma técnica cromatográfica. Entre estas substâncias isoladas destacam-se o AMA, encontrado em abundância nos frutos, o AMB, espinasterol, um ácido graxo de cadeia longa e um álcool graxo de cadeia longa, que foram encontrados nos caules e folhas.

Este trabalho deu continuidade ao isolamento e identificação de substâncias oriundas dos frutos. Como demonstrado, foi possível isolar novamente o AMA, além de um lipídio, caracterizado como um triglicerídeo que foi denominado TGL.

As avaliações espectroscópicas de RMN condizeram com os resultados encontrados anteriormente por Gazoni (2009), demonstrando realmente que o

composto isolado tratava-se do AMA. O TGL, também caracterizado por RMN, apresentou resultados que foram comparados com a literatura, indicando sinais caracerísticos do núcleo glicerídico, bem como das cadeias dos ácidos graxos insaturados acoplados ao núcleo do glicerol (GUILLÉN; RUIZ, 2001; COLZATO et al. 2008).

Até o presente momento não há relatos científicos do isolamento de um triglicerídeo dos frutos desta espécie, bem como a caracterização farmacológica deste composto sobre a DA, o que viabiliza as investigações realizadas com este composto.

Em virtude do bom rendimento, facilidade em isolar e identificar um composto, com características de marcador fitoquímico para o ERF, procedeu-se uma avaliação do fingerprint deste extrato por RMN. Os espectros obtidos mostraram um perfil bastante simples para o extrato, com predominâncias dos dois compostos isolados. A avaliação metabolômica de extratos vegetais através de RMN permitiu analisar a composição química de extratos, bem como identificar a presença de compostos através da análise dos sinais específicos das substâncias (HEINRICH, 2008).

Investigações metabolômicas têm permitido aos pesquisadores identificar diferentes compostos em extratos de maneira rápida e precisa. Liu e colaboradores (2010) utilizaram esta estratégia espectroscópica para diferenciar fitoquimicamente extratos das espécies Artemisia afra e Artemisia annua, plantas medicinais utilizadas no tratamento da Malária.

A análise de substâncias naturais é um domínio tradicional da espectroscopia de RMN. Aplicações quantitativas estão sendo estudadas e evoluindo ao longo dos anos. Estas análises vêm sendo cada vez mais procuradas, porque uma grande quantidade de novos compostos, de interesse farmacêutico derivam de produtos de origem natural (PAULI; JAKI; LANKIN, 2005).

A avaliação do potencial terapêutico desses compostos é quase sempre confrontada com uma insuficiência na viabilização de padrões primários de referência. Outra barreira encontrada é a síntese destes padrões analíticos para quantificar estas substâncias naturais, que muitas vezes é muito complicada e cara, ou, não é possível. Para produzir um padrão analítico, os compostos ativos devem ser isolados de sua fonte natural e purificados ao máximo. Além disso, o

procedimento analítico deve ser capaz de detectar o padrão e tornar a análise viável em relação ao extrato de origem (EISENREICH; BACHER, 2007)

Diversos compostos não podem ser detectados utilizando apenas um método cromatográfico por diversas razões, entre elas a incapacidade da captação dos sinais pelos detectores. Por outro lado, muitos compostos não apresentam a volatilidade necessária para análises em cromatografias gasosas, incapacitando a utilização desta metodologia (WOLFENDER; NDJOKO; HOSTETTMANN, 2003;

KESTING; HUANG; SORENSEN, 2010). Dessa forma, a caracterização de extratos de plantas farmacologicamente relevantes com métodos cromatográficos, é freqüentemente complicada devido a sua composição heterogênea. Por outro lado, nos espectros de RMN de extratos vegetais, quase todas as moléculas solúveis podem ser determinadas devido à resposta molecular (MALET-MARTINO;

HOLZGRABE, 2011).

O RMN é um método qualitativo e quantitativo satisfatório que permite a análise de misturas complexas de extratos naturais além da definição da estrutura molecular para propósitos cromatográficos, sem qualquer padrão natural correspondente. Além disso, esta técnica se mostra vantajosa em relação aos demais métodos químicos analíticos, pois além de requerer pouca preparação e ser rápido, o espectro resultante permite obter parâmetros e informações de interesse e de imediata comparação (CABRINI, 2007).

A análise de RMN do ERF possibilitou a identificação dos sinais pertinentes aos compostos isolados AMA e TGL. Através da identificação destes sinais exclusivos, foi possível realizar a determinação da integral do mesmo, o que permitiu a verificação da proporção entre os compostos no ERF. Esta determinação resultou em uma proporção de 1,5 de TGL para 1,0 de AMA, o que demonstra a superioridade na concentração do TGL dentro do ERF.

A R. ferruginea têm apresentado diversas atividades farmacológicas importantes, com propriedades antinociceptiva em modelos de dor aguda, bem como modelos de dores crônicas. Uma ação aintihipernociceptiva foi obtida com ácidos benzóico prenilado AMB, obtidos da planta, em modelos de hipernocicepção.

O AMB exibiu propriedade antinociceptiva em modelos de dor aguda em ratos e camundongos (HESS, 2006), sendo que, o mecanismo de ação dessa propriedade parece ser mediado pelos sistemas cujo mecanismo de ação envolve interações com os sistemas L-arginina-óxido nítrico, serotoninérgico, colinérgico, bem como

interações com receptores α-adrenérgicos (HESS et al., 2010). Devido aos excelentes resultados em modelos de dor aguda, o AMB também foi testado em modelos de dores crônicas, como a dor neuropática induzida por diabetes (GALVAN, 2007), ou agentes flogísticos como a carragenina, substância P, histamina, adrenalina, capsaicina, dentre outros (ANTONIALLI, 2008). Adicionalmente, uma ação aintihipernociceptiva foi obtida com o composto em modelos de hipernocicepção, como o modelo da constrição do nervo ciático em ratos, bem como a hipernocicepção induzida pelo completo adjuvante de Freund (CFA), carragenina e Prostaglandina E2 (PGE2) em camundongos (ANTONIALLI, 2009).

Extratos e compostos da planta foram testados frente à atividade da enzima AChE em ensaios “in vitro” realizados com cérebro total e outras estruturas cerebrais isoladas de ratos, resultando em efeito anticolinesterásico, sendo estes estudos um indicativo de uma possível ação sobre a memória, além de efeito anti-Alzheimer (GAZONNI, 2009; FILLIPIN, 2010).

No presente estudo, num primeiro momento, procurou-se verificar o efeito do ERF sobre a memória de animais normais na tarefa da esquiva inibitória, avaliando os efeitos do tratamento sobre as diversas etapas da memória (aquisição, consolidação e evocação). Izquierdo (2002) define como memória, a capacidade de um indivíduo (animal ou ser humano) armazenar informações, além de conservar e evocar aprendizados durante sua existência. Sua modulação permite ao indivíduo a modificação de determinado comportamento, além da aprendizagem e adaptação ao meio (IZQUIERDO, 2002).

O processo de memória é dividido em três etapas: a aquisição, que é a apresentação às informações (no caso do humano), e, tarefa ou comportamento novo (no caso do animal); a consolidação, que caracteriza a filtração e fixação das informações ou comportamentos adquiridos, e, a evocação, que é o resgate das informações ou comportamentos consolidados (BOUTON; MOODY, 2004). Essas etapas podem ser estudadas através de modelos animais como a esquiva inibitória (IZQUIERDO, 2002; KORNISIUK et al., 2011), o labirinto de 8 braços (radial maze), como proposto por Olton e Samuelson (1976) (JANITZKY et al., 2011), labirinto aquático de Morris (water maze) (BANIK; ANAND, 2011), dentre outros. Ratos e camundongos são os animais preferenciais para estudo com memória, mas, por questões éticas, modelos de memória estão sendo padronizados com peixes da espécie Danio rerio, conhecido como Zebrafisher (BROGLIO et al., 2010), répteis,

como a tartaruga Pseudemys nelsoni (DAVIS; BURGHARDT, 2007) e até mesmo insetos, sobretudo moscas da espécie Drosophila melanogaster (MURAKAMI et al., 2010). Dos modelos de memória, a esquiva inibitória tem se destacado pela praticidade e facilidade do experimento em si. Trata-se de um modelo no qual o animal pode aprender a tarefa com um único treino, diferente, por exemplo, de modelos como o labirinto aquático de Morris, radial maze e a esquiva ativa, os quais requerem diversas sessões de treino (LOPEZ et al., 2010). A memória da esquiva inibitória tem sido exaustivamente estudada por pesquisadores renomados como Kandel (LI et al., 2009), McGaughe e Roozendaal (BARSEGYAN et al, 2010), Medina (BONINI et al., 2007), Izquierdo (MYSKIW et al., 2010) dentre outros.

Izquierdo e colaboradores (2008), têm estudado a memória da esquiva inibitória farmacológica e bioquimicamente nas 4 últimas décadas, reunindo evidências entre a memória da esquiva inibitória e o processo da potencialização de longa duração (LTP), um processo de neuroplasticidade cerebral descoberto por Blis e Gardner- Medwuin (1973), descrito como modelo neurofisiológico de memória (SALE et al., 2011).

Na tarefa da esquiva inibitória, também denominada esquiva passiva, o animal é colocado sobre uma plataforma, e, ao descer da plataforma, para explorar o aparato, recebe um choque elétrico de intensidade variável (dependendo do protocolo adotado) nas patas. Por conseqüência deste choque, o animal “aprende” a permanecer na plataforma para evitar o choque, ou seja, ele se esquiva de explorar o ambiente, inibindo um comportamento natural. Neste tipo de teste, o animal é apresentado a um estímulo aversivo, em associação a um estímulo inicialmente neutro do ambiente (FOWLER et al., 2011). Em função disso, o aprendizado se dá rapidamente, uma vez que, instintivamente, os animais procuram evitar essas situações aversivas. Dessa forma, a resposta da esquiva é, então, simplesmente uma resposta de fuga com latência reduzida (WANG; CHAI; HOLAHAN, 2010).

Os estudos dos efeitos de compostos puros ou extratos de plantas sobre as etapas da memória podem ser realizados, dependendo do protocolo utilizado, independente do modelo animal escolhido. Dessa forma, todas as etapas da memória têm sido caracterizadas farmacologicamente e bioquimicamente (OJHA et al., 2010).

No presente estudo, o tratamento de animais normais com ERF produziu efeito sobre a memória de ratos, avaliados no modelo da esquiva inibitória,

facilitando a memória dos mesmos, independentemente da etapa da memória avaliada. Em relação aos efeitos observados com o extrato da R. ferruginea, esta espécie apresenta diversos ácidos benzóicos prenilados como componentes majoritários (HIROTA et al., 2002; GAZONI, 2009). Os ácidos benzóicos prenilados (como o AMA) encontrados na espécie estudada possuem característica apolar podendo facilmente atravessar a barreira hematoencefalica dos animais e atingir regiões cerebrais importantes no processo de memória. Os efeitos desses compostos sobre o SNC são pouco explorados farmacologicamente, entretanto, já foram descritos na literatura efeito antioxidante (YAMAGUCHI et al., 2006) , podendo tal efeito ser relacionado com os resultados facilitatórios do ERF observados no presente estudo

A facilitação das etapas da memória (aquisição, consolidação e evocação), verificadas nos testes da esquiva inibitória realizados, pode também estar relacionada com a alta concentração destes ácidos benzóicos no extrato utilizado, uma vez que os mesmos têm apresentado atividade anticolinesterásica em diversos estudos realizados em nossos laboratórios (GAZONI, 2009; FILLIPIN, 2010).

A inibição das enzimas acetilcolinesterases é atualmente o mecanismo de ação dos principais medicamentos aprovados para o tratamento da DA (EPIS et al., 2010). Através da inibição da hidrólise enzimática da ACh pela AChE, este neurotransmissor tem a possibilidade de estimular os neurônios colinérgicos remanescentes do hipocampo e córtex cerebral, os quais estão sendo degradados pela patologia. Este mecanismo possibilita uma transmissão colinérgica mais eficaz e melhora significativamente os processos de memórias (declarativas e não declarativas) dos portadores da DA (MENICHINI et al., 2009).

A relação entre a ACh, memória e DA tem sido extensivamente estudada nos últimos anos (TAYEBATI; AMENTA, 2008). A participação da neurotransmissão colinérgica no processo de memória, sobretudo na etapa da consolidação já foi ricamente evidenciada em diversos modelos animais (POWER; VAZDARJANOVA;

MCGAUGH, 2003; PEPEU; GIOVANNINI, 2010) como também em seres humanos (LANE; POTKIN; ENZ, 2006). A indução de amnésia temporária por escopolamina (um antagonista dos receptores mucarinicos) em modelos animais, têm sido bastante utilizada por pesquisadores no screening de substâncias com possíveis efeitos sobre a DA (KLINKENBERG; BLOKLAND, 2010). Além disso, a escopolamina também foi usada clinicamente (embora menos freqüentemente do

que em anos passados) como um adjuvante aos procedimentos cirúrgicos ou de obstetrícia para induzir sedação e amnésia pós-procedimento (BUCAFUSCO, 2009).

Os extratos brutos das plantas contêm milhares de substâncias, o que torna difícil a caracterização do mecanismo de ação exato, pois os compostos podem estar interagindo entre si e atuando em sinergismo. Porém, os estudos realizados por Gazoni (2009) e Fillipin (2010), reforçam a ação característica do ERF e do AMA na inibição das colinesterases em ensaios preliminares.

Assim sendo, é possível conjecturar que a ação verificada nos modelos de memória para o extrato dos frutos da Rapanea ferruginea em animais normais pode estar relacionada com esta inibição enzimática. Os resultados apresentados demonstraram que o ERF facilitou o desenvolvimento da atividade na esquiva inibitória através, do aumento da cognição dos ratos em todas as doses utilizadas.

Analisando os dados obtidos, é possível verificar que a dose de 150 mg/kg foi capaz de proporcionar uma inibição da descida da plataforma muito semelhante à dose de 300 mg/kg, onde todos os animais não desceram da plataforma no teste. Dessa forma, as doses de 150 e 300 mg/kg proporcionaram a manutenção da memória dos animais de maneira eficiente e significativa. Verificou-se ainda, uma grande discrepância nas latências de descida entre os animais que receberam o ERF em relação aos animais normais, que receberam apenas o veículo (solução salina), demonstrando que os animais agiram de maneira significativamente diferente após o aprendizado da tarefa. Este fato impulsionou-nos a realizar a avaliação do potencial do ERF sobre a memória de animais com DA induzido.

Como relatado anteriormente, a DA é atualmente a desordem neurodegenerativa com maior numero de casos diagnosticados no mundo. A DA é caracterizada por um progressivo déficit cognitivo, bem como diminuição da memória (RAFII; AUSEN, 2009). Além disso, a DA é uma patologia que apresenta anormalidades no metabolismo da glicose, onde ocorre uma redução de sua utilização, bem como alterações na metabolização do fosfato energético adenosina trifosfato (ATP). Os distúrbios no metabolismo energético estão intrinsecamente associados a um aumento de estresse oxidativo, o qual pode ser resultado de oxidação de biomoléculas, e início de excitotoxicitade neuronal (TOTA et al., 2010).

Considerando que a DA apresenta disfunções oxidativas importantes já relatadas na literatura (AGOSTINHO; CUNHA; OLIVEIRA, 2010), foi escolhido o

modelo da STZ, o qual possibilita a indução de dano oxidativo nos animais, para a avaliação da atividade do ERF e dos compostos isolados, AMA e TGL.

O modelo farmacológico, utilizado para indução de déficit de memória nos animais, foi a administração de doses subdiabetogênicas de STZ, através de administrações ICV em roedores. Esse modelo tem sido bem aceito pela comunidade científica devido à mimetização de vários aspectos patológicos da DA, como, progressiva deterioração da memória, redução do metabolismo da glicose e energia cerebral, indução de estresse oxidativo e promoção de disfunção colinérgica (AWASTHI, 2010; PINTON et al., 2010). A diminuição da utilização cerebral da glicose, e, os déficits no metabolismo energético representam anormalidades encontradas em estágios iniciais de deficiência cognitiva, como é apontado em diversos casos de DA (JEE et al., 2008).

A administração da STZ possibilita uma dessensibilização dos receptores neuronais da insulina e redução da atividade das enzimas glicolíticas, causando redução da energia cerebral, e, levando a uma disfunção cognitiva pela inibição da síntese de ATP. Além disso, a redução da glicose cerebral a níveis críticos afeta o sistema colinérgico, pois ocorre um decréscimo na síntese de acetilcolina, devido à diminuição da concentração de acetil-CoA, que é um derivado de glicose (SHOHAM et al., 2007; SHARMA; SINGH; SINGH, 2008).

Além disso, a glicose é metabolizada em produtos energéticos, e, é transformada em fonte de energia para o cérebro. Por este motivo, interrupções no metabolismo energético afetam criticamente as funções cerebrais, além de síntese protéica e processos celulares e moleculares básicos (SPITALER et al., 2002).

Ishrat e colaboradores (2006) demonstraram ainda que a administração ICV de STZ reduz a atividade da acetiltransferase (ChAT) no hipocampo, fator que acarreta em uma deficiência de transmissão colinérgica, a qual é determinante na redução da memória dos animais.

No presente estudo, o modelo da STZ foi utilizado conforme descrito por Pinton e colaboradores (2010). Durante o procedimentos, duas infusões de STZ (2,5 mg/mL – 2 µL) foram administradas, em um intervalo de 48 horas entre cada dose, para a indução de DA, causando nos animais em estudo uma significante redução nas latências de descida como verificado nos animais tratados com veículo (NaCl 0,9%), e, testados na esquiva inibitória.

O déficit de memória causado pela STZ foi revertido pela administração do ERF, sendo a ação da dose máxima utilizada, superior ao fármaco de referência Galantamina. Na literatura, já foram evidenciados efeitos de extratos de plantas (VEERENDRA; GUPTA, 2003), fitoconstituintes como flavonóides (AWASTHI et al., 2010), e carotenóides (KHALILI; HAMZEH, 2010), revertendo e/ou prevenindo os efeitos deletérios da STZ sobre a memoria de animais, da mesma maneira como observado no estudo em questão.

Neste estudo, a administração de apenas uma dose do ERF foi capaz de reverter os prejuízos gerados pelos danos energéticos e estresse oxidativo induzidos pela STZ. Entretanto, Deshmukh e colaboradores (2009), e, Bhutada e colaboradores (2010), realizando experimentos com a mesma metodologia, necessitaram de administração prolongada dos compostos vimpocetina e quercetina para melhora do processo cognitivo dos animais.

A STZ, administrada ICV, no ventrículo cerebral dos animais avaliados, tem a capacidade de alterar a bioquímica local, destruindo diversos neurônios e danificando a transmissão colinérgica destes animais (PIAZZA et al., 2011). Este fato é facilmente verificado quando se analisam os resultados dos animais pré- tratados com o veículo, os quais não tiveram habilidade cognitiva para realizar a tarefa aprendida.

Os resultados obtidos nesta avaliação monstraram que a administração do ERF tem a capacidade de facilitar o aprendizado dos animais com o déficit cognitivo causado pela indução da DA, caracterizando uma ação farmacológica bastante significativa. Além disso, como observado nos resultados, a Galantamina, utilizada como controle positivo, apresentou a atividade esperada, melhorando a memória dos animais de maneira significativa em relação ao controle negativo. Entretanto, a ação do ERF equivale-se a ação do fármaco de referência, uma que vez não se encontrou diferenças estatísticas significativas entre os grupos.

Um dos compostos isolados do ERF avaliados no presente estudo foi o TGL.

A determinação dos efeitos do TGL sobre os déficits de induzida por STZ foi realizada utilizando-se o modelo da esquiva inibitória. Os resultados encontrados demonstraram que o TGL foi capaz de facilitar a memória dos animais, e, que o grupo que recebeu tratamento apenas com o veículo foi incapaz de “recordar” a tarefa aprendida. Este fato foi verificado através do aumento da latência de descida dos animais na sessão teste. Entretanto, verificou-se que o desempenho dos

animais que receberam a menor dose do TGL (5 mg/kg) foi superior as outras doses utilizadas (15 e 30 mg/kg).

A busca de agentes capazes de proteger o organismo contra a amiloidogênese e danos oxidativos é o objetivo das futuras terapias contra a DA. Um tratamento interessante seria conseguir intervenções relacionadas à dietética.

Corroborando com esta situação, verifica-se a existência de muitos estudos relacionados com o consumo de ácidos graxos poliinsaturados e DA (HASHIMOTO et al, 2005; SUMIYOSHI et al., 2008).

Recentemente um estudo farmacológico pré-clínico revelou que uma dieta rica em gorduras poliinsaturadas e polifenóis, influenciam o processo de neurogênese. Camundongos tratados com uma dieta rica em ácidos graxos poliinsaturados e polifenóis apresentaram uma maior proliferação de neurônios no bulbo olfatório e no hipocampo, regiões cerebrais comumente comprometidas em doentes que sofrem de DA (VALENTE et al., 2009).

Ao contrário do que se pensava anteriormente, sabe-se que os neurônios continuam a surgir durante a fase adulta do indivíduo, porém a capacidade de neurogênese do cérebro é limitada a duas áreas: o bulbo olfatório e o hipocampo (VALENTE et al., 2009). Segundo Valente e colaboradores (2009), uma dieta rica em polifenóis e ácidos graxos poliinsaturados, influencia significativamente na prevenção da DA, e eventualmente contribui com a boa manutenção das funções cerebrais.

Após metabolização enzimática pelas lipases digestivas, o TGL pode ter disponibilizado para o organismo dos animais uma determinada concentração de ácidos graxos poliinsaturados, os quais podem ter influenciado na manutenção da capacidade cognitiva dos mesmos, facilitando o desenvolvimento da memória durante os testes.

Nossos resultados corroboram com as hipóteses de Valente e colaboradores (2009), e Sumiyoshi e colaboradores (2008), demonstrando que uma dieta contendo ácidos graxos poliinsaturados pode caracterizar um tratamento preventivo contra a DA. Todavia, os resultados obtidos neste estudo foram adquiridos realizando uma administração aguda do TGL. Sendo assim, tais resultados, subsidiam novos experimentos utilizando tratamento crônico sob animais com DA induzida, visando obter um perfil da administração prologada deste composto sobre a memória dos mesmos.