Avaliação do fenótipo celular e perfil de citocinas

69 4.7.7 Avaliação do fenótipo celular e perfil de citocinas intracitoplasmáticas em monócitos

POPULAÇÃO, MATERIAIS E MÉTODOS

70

Granulosidade

CD14-PerCP

A

197,0 (IMF Leish⁺)

4,2 (IMF Leish^-)

X 50,0 ^{(% Leish+)}

Capacidade fagocítica relativa = 2339,7

FL-1

CD14-PerCP

Leish- B

49,2%

Leish+

50,0%

Leish- 4,2 IMF

Leish+

197,0 IMF

Figura 11: Estratégia para cálculo do índice “Capacidade fagocítica relativa”. A figura 11A representa o perfil celular da população de monócitos, selecionada na janela “gate” monócitos em gráfico de densidade de fluorescência-3 (CD14-PerCP) versus granulosidade. 11B representa o perfil de análise de monócitos Leish^- e Leish⁺ em gráfico de contorno de fluorescência-1 (FL-1) versus fluorescência-3 (CD14-PerCP). A fórmula utilizada para cálculo do índice “Capacidade fagocítica relativa” está ilustrada dentro do gráfico.

4.7.7.1 Aquisição e análise ex vivo do fenótipo celular de monócitos do sangue periférico por citometria de fluxo

A identificação da população celular de interesse e a determinação do valor percentual/IMF dos marcadores fenotípicos avaliados foram realizadas pelo software FlowJo.

As Figuras 12 e 13 representam, de forma esquemática, o método utilizado para a análise desses resultados. A primeira estratégia (Figuras 12A e 13A) consistiu na identificação da população de monócitos, que foi selecionada por uma janela - “gate”, através da construção de gráficos de densidade de fluorescência-3 (FL3, CD14-PerCP) versus granulosidade celular (Side Scatter - SSC). A Figura 12B ilustra, no quadrante duplo positivo (Q2), a detecção da molécula de ativação CD23 na população de monócitos, em gráfico de densidade de fluorescência-2 (FL2, CD23-PE) versus fluorescência-3 (FL3, CD14-PerCP). A Figura 13B representa a detecção do receptor do complemento CD35 na população de monócitos, em gráfico de histograma de número de eventos versus fluorescência-2 (FL2, CD35-PE).

71 CD14-PerCP

Granulosidade CD14-PerCP

CD23-PE

A

B

Figura 12: Análise do fenótipo celular de monócitos do sangue periférico da população avaliada (grupo com teste de Montenegro positivo sem lesão - TM⁺sL) por citometria de fluxo. A figura 12A representa o perfil celular da população de monócitos, selecionada na janela “gate” monócitos em gráfico de densidade de fluorescência-3 (CD14-PerCP) versus granulosidade. A figura 12B representa o perfil de análise da população de monócitos positivos para CD23 no quadrante duplo positivo (Q2) em gráfico de zebra de fluorescência-2 (CD23- PE) versus fluorescência-3 (CD14-PerCP).

CD14-PerCP

Granulosidade Noeventos

CD35-PE

A B

IMF 60,2

Figura 13: Análise do fenótipo celular de monócitos do sangue periférico da população avaliada (grupo com leishmaniose cutânea - LC) por citometria de fluxo. A figura 13A representa o perfil celular da população de monócitos, selecionada na janela “gate” monócitos em gráfico de densidade de fluorescência-3 (CD14-PerCP) versus granulosidade. A figura 13B representa a detecção da molécula CD35 na população de monócitos, em gráfico de histograma de fluorescência-2 (CD35-PE) versus número de eventos.

4.7.7.2 Aquisição e análise pós-estimulação in vitro de citocinas intracitoplasmáticas em monócitos e linfócitos T CD4⁺ e CD8⁺ do sangue periférico por citometria de fluxo

A identificação da população celular de interesse e a determinação do valor percentual de citocinas intracitoplasmáticas avaliadas foram realizadas pelo software FlowJo. As Figuras 14, 15 e 16 representam, de forma esquemática, o método utilizado para a análise desses

POPULAÇÃO, MATERIAIS E MÉTODOS

72 resultados. A primeira estratégia consistiu na identificação das populações de monócitos (Figura 14A) e linfócitos totais (Figuras 15A e 16A). A população de monócitos (Figura 14A) foi selecionada conforme descrito no item 4.7.7.1 (Figuras 12A e 13A) da metodologia. A Figura 14B ilustra, no quadrante duplo positivo (Q2), a detecção intracitoplasmática da citocina TNF- na população de monócitos, em gráfico de densidade de fluorescência-2 (FL2, TNF-α-PE) versus fluorescência-3 (FL3, CD14-PerCP).

A população de linfócitos totais foi selecionada por meio de gráficos de densidade de tamanho celular (Forward Scatter - FSC) versus granulosidade celular (Figuras 15A e 16A). A Figura 15B ilustra, no quadrante duplo positivo (Q2), a detecção intracitoplasmática da citocina IL-4 na população de linfócitos T CD4⁺, em gráfico de densidade de fluorescência-2 (FL2, IL-4-PE) versus fluorescência-3 (FL3, CD4-PerCP). A Figura 16B ilustra, no quadrante duplo positivo (Q2), a detecção intracitoplasmática da citocina IL-10 na população de linfócitos T CD8⁺, em gráfico de densidade de fluorescência-2 (FL2, IL-10-PE) versus fluorescência-3 (FL3, CD8-PerCP).

CD14-PerCP

Granulosidade CD14-PerCP

TNF--PE

A

B

Figura 14: Análise de monócitos do sangue periférico da população avaliada (grupo com leishmaniose cutânea - LC) por citometria de fluxo. A figura 14A representa o perfil celular da população de monócitos, selecionada na janela “gate” monócitos em gráfico de densidade de fluorescência-3 (CD14-PerCP) versus granulosidade. A figura 14B representa o perfil de análise da população de monócitos positivos para citocina TNF-α no quadrante duplo positivo (Q2) em gráfico de zebra de fluorescência-2 (TNF-α-PE) versus fluorescência-3 (CD14-PerCP).

73 Tamanho

Granulosidade CD4-PerCP

IL-4-PE

A

B

Figura 15: Análise de linfócitos T CD4⁺ do sangue periférico da população avaliada (grupo controle - CT) por citometria de fluxo. A figura 15A representa o perfil celular da população de linfócitos totais, selecionada na janela “gate” linfócitos totais em gráfico de densidade de tamanho versus granulosidade. A figura 15B representa o perfil de análise da população de linfócitos TCD4⁺ positivos para citocina IL-4 no quadrante duplo positivo (Q2) em gráfico de zebra de fluorescência-2 (IL-4-PE) versus fluorescência-3 (CD4-PerCP).

Tamanho

Granulosidade CD8-PerCP

IL-10-PE

A

B

Figura 16: Análise de linfócitos T CD8⁺ do sangue periférico da população avaliada (grupo controle - CT) por citometria de fluxo. A figura 16A representa o perfil celular da população de linfócitos totais, selecionada na janela “gate” linfócitos totais em gráfico de densidade de tamanho versus granulosidade. A figura 16B representa o perfil de análise da população de linfócitos TCD8⁺ positivos para citocina IL-10 no quadrante duplo positivo (Q2) em gráfico de densidade de fluorescência-2 (IL-10-PE) versus fluorescência-3 (CD8-PerCP).

4.7.8 Avaliação dos níveis de óxido nítrico intracelular em monócitos do sangue periférico,