3.3 Experimento IIb
3.3.2 Delineamento Experimental
3 MATERIAIS E MÉTODOS 77
3.3.2.2 Considerações Bioéticas
Todos os procedimentos realizados seguiram em consonância com as normas estabelecidas pela Comissão de Pesquisa e Ética em Saúde contidas na Pesquisa em Saúde e Direito dos Animais, de autoria do grupo de pesquisa e de Pós-Graduação do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA)160 bem como o preconizado no Principles for Research Involving Animals.
O número de animais utilizados no estudo amparou-se em cálculo amostral, o qual refere que, para detectar uma diferença entre as médias das variáveis em estudo de 1,8 desvio padrão (magnitude de grande efeito), considerando-se α=0,05 e poder de confiança de 90%, são necessários, no mínimo, oito animais por grupo.
O presente estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital de Clínicas de Porto Alegre e, solicitado fomento junto ao Fundo de Incentivo a Pesquisa e Eventos do HCPA, sob o número de protocolo 09-050.
3.3.2.3 Modelo Experimental
A indução da EHNA foi realizada através da oferta ad libitum da ração MCD durante 4 semanas. Os animais do grupo controle receberam a mesma ração, porém com a inclusão de metionina e colina nas concentrações descritas em seu composto.
Os animais foram divididos aleatoriamente em quatro grupos: controle + veículo (CO + V): 8 camundongos receberam a ração controle (com a adição de metionina e colina) mais veículo; controle + quercetina (CO + Q) : 8 camundongos receberam a ração controle mais quercetina 50 mg / kg; esteato-hepatite não alcoólica + veículo (EHNA + V): 8 camundongos que receberam a dieta MCD mais veículos; e para o grupo esteato-hepatite não alcoólica + quercetina (EHNA + Q): 8 camundongos que receberam a dieta MCD mais quercetina 50 mg / kg. Todos os animais receberam, uma semana antes de começar o experimento, a ração controle para adaptação à nova alimentação.
Veículo foi composto por carboximetilcelulose sódica (CMCNa) 1% que também foi empregado como um portador para Q. A quercetina foi administrada intragastricamente em uma concentração de 50 mg / kg de peso do animal, por 4 semanas. Essa dose foi definida a partir de achados anteriores177 e por estudo piloto.
No dia 1 do experimento, os animais foram aleatoriamente distribuídos para os grupos conforme a sua dieta correspondente. Os animais foram pesados e monitorados durante todo o experimento.
3.3.2.4 Eutanásia dos animais
Transcorrido o período de tempo (4 semanas), os animais foram pesados e receberam anestesia inalatória com Isoflurano® para realização da coleta de sangue do plexo retro- orbital.
Os animais sofreram eutanásia, ao final do experimento, por exanguinação sob anestesia profunda, seguida de deslocamento cervical conforme descrito em AVMA Guidelines from Euthanasia161. Para a retirada do fígado, foi realizada uma laparotomia ventral média com hepatectomia total e preparo do material para análise histológica e congelamento em nitrogênio líquido do tecido restante.
Os fígados foram seccionados e os seus lobos divididos em uma fração para histologia, fixados em solução de formol a 10% por 24 horas e emblocados em parafina para posterior coloração. O restante do tecido foi utilizado para as demais análises.
Os corpos dos animais foram acondicionados em embalagens específicas para desprezo e mantidos em freezer até sua incineração, realizada pelo setor responsável do Centro de Investigação Animal do Hospital de Clínicas de Porto Alegre.
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3.3.2.5 Análise Histopatológica
Para realização da análise microscópica, as lâminas dos fragmentos hepáticos foram coradas com hematoxilina e eosina (HE), sendo analisadas por um único patologista,
“cegado”, sem conhecimento dos grupos em relação aos animais.
O critério histológico mínimo para o diagnóstico de EHNA foi a presença de esteatose associada à balonização hepatocelular, envolvendo a zona 3 e infiltrado inflamatório lobular162. Os corpúsculos de Mallory e a fibrose sinusoidal, envolvendo a zona 3, podiam ou não estar presentes163. A graduação tanto da atividade necroinflamatória como da fibrose foi realizada, segundo a classificação proposta por BRUNT et al.162. O escore utilizado para a classificação da EHNA foi o recomendado pelo Pathology Committee of EHNA Clinical Research Network164, classificando semi-quantitativamente esteatose (0-3), inflamação lobular (0-2), balonização hepatocelular (0-2) e fibrose (0-4).
A análise qualitativa foi realizada em microscópio binocular Nikon Labophot (Tokyo, Japan), equipado com câmera digital e conectado a um programa de captura de imagem (Image-Pro Plus by Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA).
3.3.2.6 Análise Imuno-histoquímica
A imuno-histoquímica foi realizada para verificação da ativação das células estreladas no tecido hepático e, como marcador para estas células ativadas, foi utilizada a -SMA (Alpha-Smooth Muscle Actin). Foi utilizado anticorpo policlonal -SMA (Abcam, Cambridge, UK). Cada secção foi desparafinizada com xilol e reidratada com diferentes graus de álcool.
A recuperação de antígeno foi feita em micro-ondas (300W) em buffer citrato (pH 6.0) a 100°C, e a atividade da peroxidase endógena foi bloqueada pela incubação das lâminas em metanol absoluto, contendo 3% de peróxido de hidrogênio, à temperatura ambiente. Os cortes foram sequencialmente pré-incubados com 10% de soro de coelho, à temperatura ambiente, para bloquear possíveis reações indesejadas do anticorpo secundário. As lâminas foram incubadas com anticorpo -SMA na diluição 1:200. Após sessenta minutos em temperatura
ambiente, elas foram tratadas com reagente EnVision (Dako®, Glostrup, Dinamarca). Logo, foram realizados três lavagens com PBS e 3,39-diaminobenzidina foi utilizada como cromógeno. Os núcleos foram contracorados com hematoxilina. O anticorpo primário foi diluído em PBS, contendo 0,1% de albumina bovina como controle negativo. Os resultados foram avaliados por um patologista “cegado”, sem conhecimento prévio dos grupos, através de microscópio equipado com câmera digital para captura de imagens através do software Image-Plus (Media Cybernetics, Bethesda, USA).
3.3.2.7 Análises Bioquímicas de Integridade Hepática
Para verificação da integridade hepática foram utilizadas as dosagens sangüíneas das enzimas aspartato aminotransferase (AST), alanino aminotranferase (ALT) e fosfatase alcalina (FA).
Na determinação da AST e da ALT no plasma foi utilizado o método enzimático comercial (Boehringer Mannheim, Alemanha). Assim, a atividade enzimática do AST e ALT foi obtida através da medição cinética a 567 nm.
A AST catalisou a reação do -cetoglutarato e do ácido alanína sulfínico a piruvato e glutamato. A ALT catalisou a reação do -cetoglutarato e alanina a piruvato e glutamato. O piruvato se hidrolisou a acetilfosfato, após a ação do piruvato oxidase (POD), anidrase carbônica e peróxido de hidrogênio (H2O2). Em presença de POD, o H2O2 oxidou a forma reduzida incolor do indicador à forma azul.
Para determinação da atividade da FA no plasma foi empregado o método enzimático automatizado. Para isto, utilizou-se como substrato o para-nitrofenilfosfato mais água, que formou para-nitrofenol, um composto intensamente amarelo, com um máximo de absorbância de 400 nm.
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3.3.2.8 Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real – PCR em tempo real
Para quantificar a concentração de RNAm, utilizou-se a metodologia de PCR (reação em cadeia da polimerase) em tempo real.
Primeiramente, foi realizada extração e purificação do RNA da amostra, mediante uso de um kit comercial (Promega Corporation, Madison, USA). Após esse procedimento, foi quantificado o total de RNA nas amostras, mediante utilização de espectrofotômetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Products, Wilmington, USA) e, posteriormente, realizou-se por meio do sistema High-Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Foster City, USA)178 a conversão de RNA a cDNA, baseando-se na capacidade da transcriptase reversa em sintetizar uma cadeia complementar de DNA (cDNA) a partir de uma sequência molde de RNA.
Como procedimento sequencial, realizou-se a técnica de PCR, em tempo real, de acordo com o descrito por Mullis e Faloona, em 1987, e por Saiki e colaboradores, em 1988, com base no processo natural de replicação do DNA com amplificação cíclica179, 180. O método constou de três etapas: desnaturação, anelamento e alongamento, efetuados de forma sucessiva em condições controladas de temperatura e tempo.
Foram também utilizados os demais materiais, como sondas TaqMan para fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) (Rn01525859_g1 e GenBank acesso nº NP036807.1), ciclo- oxigenase-2 (COX-2) (Rn01483828_m1 e GenBank acesso nº AF233596.1), fator de crescimento transformador- (TGF-) (Rn00572010_m1 e GenBank acesso nº AY550025.1), proteína de alta mobilidade do grupo B1 (HMGB-1) (Rn02377062_g1 e GenBank acesso nº BC081839.1), metaloproteinase de matriz – 9 (MMP-9) (Rn00579162_m1 e GenBank acesso nº U24441.1), fator de crescimento do tecido conectivo (CTGF) (Rn01537279_g1 e GenBank acesso nº AB023068.1) e anfirregulina (AREG) (Rn00567471_m1 e GenBank acesso nº X55183.1). Esses genes foram avaliados através de ensaios de expressão TaqMan, sendo utilizado TaqMan Universal PCR Master mix (Applied Biosystems, Foster City, USA)181.
A amplificação foi realizada em termociclador StepOne Plus, real-time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, USA). Em cada ensaio, foi incluído um controle vazio e um controle negativo. O número de ciclos transcritos detectados foram normalizados com o
número de ciclos para detecção do gene constitutivo HPRT (hipoxantina fosforribotransferase) (GenBank acesso n M63983.1 e Rn01527840_m1), utilizado como housekeeping, que codifica para a hipoxantina fosforribosil transferase.
As mudanças relativas aos níveis de expressão gênica foram determinadas, conforme o descrito por Livak e Schmittgen, em 2001, mediante o cálculo de 2–ΔΔCt 181.
3.3.2.9 Analises por Western Blotting
Foi utilizado o sistema descrito por Laemmli e colaboradores (1970) para a eletroforese 182, e para o blotting, a técnica descrita por Towbin e colaboradores (1979) 183. Selecionou-se a quantidade de amostra equivalente a 30 µg de proteína. Adicioou-se uma solução de H2O, tris/HCl 0,5 M, DTT 1% e azul de bromofenol, incubando-a durante cinco minutos a 100ºC. Posteriormente, realizou-se a eletroforese em gel de poliacrilamida a 12%
em tampão de eletroforese (Tris 25 mM, glicina 0,2 M, SDS 3,5 mM; pH 8,8). Depois de separadas, as proteínas foram transferidas para uma membrana de Polifluorofuro de Vinilideno (PVDF), a fim de permitir a sua exposição aos anticorpos. Para realizar a transferência, uma vez extraído o gel, este foi equilibrado em um tampão de transferência (Tris 25 mM, glicina 0,2 M e metanol 20%). A transferência foi realizada a 13 V durante 25 minutos. A membrana foi lavada com agitação durante dez minutos com PBS (0,14 M NaCl, 1,4 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4, 2,7 mM KCl), depois foi colocada durante trinta minutos em solução de bloqueio (leite em pó desnatado em PBS-Tween 20 frio) a 37ºC.
A membrana de PVDF foi, então, incubada em overnight a 4º C com anticorpo primário policlonal específico para receptor toll-like 4 (TLR-4) (110 kDa) (Santa Cruz Biothecnology, Santa Cruz, USA), jun-amino-terminal quinase total e fosforilada (JNK/pJNK) (46 e 54 kDa) e GAPDH (Sigma Chemical CO®, USA) (37 kDa), esse último utilizado para fins de cálculo. Após esse período, foi lavada seis vezes, durante dez minutos, com PBS-Tween 20. Posteriormente, foi incubada durante uma hora com anticorpo anti- imunoglobulina de coelho, unido a HRP (Dako, Glostrup, Dinamarca). Transcorrido esse tempo, foi novamente lavada seis vezes, durante dez minutos, em PBS-Tween 20.
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A detecção das proteínas foi realizada por quimiluminescência, utilizando um kit comercial ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK) e, posteriormente, foi introduzida em um cassete junto com o filme de revelação (Amersham Hyperfilm ECL, UK).
Depois de revelado, o filme foi secado, e as bandas foram quantificadas por densitometria, utilizando o programa Scion Image 4.02 para Windows (Scion Corporation, Frederick, USA).
Os resultados foram expressos em unidades arbitrárias (u. a.).
3.3.2.10 Analise Estatística
Médias e erro padrão foram calculados. Os dados foram analisados usando ANOVA.
Quando um efeito significativo foi encontrado, comparações post-hoc foram realizadas utilizando o teste de Student Newman Keuls para amostras independentes. Para avaliar a significância estatística da análise histológica e imuno-histoquímica foi utilizado o teste Kruskal-Wallis para amostras independentes. Um valor de P <0,05 foi considerado significativo. Todos os cálculos foram realizados utilizando o software estatístico SPSS 14.0.