À minha família
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.3. Determinação de selenometionina por HPLC-ICP-MS
5.3.2. Estudo do procedimento de extração das espécies de selênio da amostra
Avaliação da eficiência de extração
Diversos procedimentos de extração (ver item 4.3.2) foram investigados com a finalidade de encontrar as possíveis espécies químicas de selênio presentes na amostra de levedura. Para tanto, procedimentos proteolíticos e não proteolíticos foram usados para avaliar a capacidade qualitativa e quantitativa dos reagentes utilizados para a extração das espécies de selênio.
A avaliação da eficiência de extração foi realizada pela relação entre a fração mássica de selênio total obtida no extrato e a fração mássica de selênio total obtida na amostra
digerida por HPA (2170 ± 138 mg kg-1) e analisadas por ICP OES nas condições instrumentais descritas no item 4.2.3. As eficiências de extração obtidas para os dez procedimentos empregados (item 4.3.2) estão apresentadas na Figura 20.
Figura 20 - Eficiência de extração de selênio utilizando diferentes procedimentos (valor de referência utilizado para calcular a eficiência de extração: 2170 ± 138 mg kg-1)
De acordo com a Figura 20, a eficiência da extração empregando Tris-HCl, pH próximo ao fisiológico pH = 7,5, foi igual ao procedimento utilizando água. Provavelmente, esses reagentes foram capazes de extrair as espécies inorgânicas e os selenocompostos livres e solúveis.
O SDS proporcionou ligeiro aumento na eficiência de extração de selênio (SDS: 21 %;
SDS + Tris-HCl: 23 %). O SDS tem a capacidade de desnaturar as proteínas mediante formação de par iônico, e torná-las solúveis em água, aumentando a eficiência de extração (HUERTA et al., 2004; WANG et al., 2009).
Outro reagente utilizado para a extração de selenocompostos foi a enzima lipase, que é capaz de liberar os selenocompostos ligados à fração lipídica. O resultado obtido por esse procedimento (13 %) foi similar àqueles obtidos com água e Tris-HCl.
As eficiências de extração para os procedimentos proteolíticos foram visivelmente maiores que os procedimentos não proteolíticos (87 % a 94 %). Esse fato pode ser explicado pela ação da protease nas proteínas com altos níveis de selênio, essa enzima age de maneira
não específica ao longo da cadeia peptídica liberando os aminoácidos contendo selênio. De acordo com Połatajko et al. (2005), a selenometionina é a espécie de selênio predominante em levedura.
Identificação das espécies de selênio nos extratos
Os perfis cromatográficos obtidos pelos procedimentos não proteolíticos (Tris-HCl, SDS, SDS + Tris-HCl e água) foram similares e baixas quantidades de selênio foram obtidas.
A identificação e a quantificação da maioria das espécies de selênio nesses extratos não foram realizadas devido à ausência de padrões das espécies de selênio no laboratório e às baixas taxas de recuperações: a intensidade do sinal de alguns picos cromatográficos estava próxima ao limite de quantificação. Os extratos não proteolíticos foram diluídos em água tipo 1 na proporção de 1:3 e o perfil cromatográfico está ilustrado na Figura 21.
Figura 21 - Perfis cromatográficos das extrações não proteolíticas (80Se)
Os cromatogramas obtidos mostraram aproximadamente 6 espécies de selênio. Para identificar os picos cromatográficos, os tempos de retenção foram comparados com os padrões disponíveis no laboratório (selenito, selenato, selenometionina e selenocistina) mediante a fortificação da amostra. De acordo com Casiot et al. (1999) os principais compostos extraídos incluem os livres, os fracamente unidos e os solúveis em água, tais como, selenito, alguns selenoaminoácidos e possivelmente trimetilselenônio e selenoglutationa.
A Figura 21 apresenta as espécies de selênio próximas ao tempo dos compostos não retidos da coluna, provavelmente a selenocistina e o óxido de selenometionina, picos 1 e 2. O
pico 3 e o pico 5 são a selenometionina e o selenito, os quais foram confirmados pelo tempo de retenção. Um pico majoritário (pico 6) eluiu em aproximadamente 28 min e não pôde ser identificado devido à ausência de padrões. A Tabela 18 apresenta os tempos de retenção das principais espécies químicas apresentadas na Figura 21.
Tabela 18 - Tempos de retenção das espécies químicas extraídas com os procedimentos não proteolíticos Pico Espécie de selênio Tempo de retenção
1,2 Óxido de selenometionina (SeOMet)
e/ou selenocistina (SeCys)2 2,23 min
3 Selenometionina (SeMet) 3,39 min
4 Não identificada 5,30 min
5 Selenito (SeO3-2
) 8,96 min
6 Não identificada 28 min
Os perfis cromatográficos resultantes das diferentes extrações com protease (Figura 22) confirmaram a selenometionina como espécie majoritária. Esse selenoaminoácido pode ser incorporado de forma inespecífica às proteínas (THIRY et al., 2012) confirmando que a maior parte do selênio presente em levedura está unida a proteínas. Outros picos próximos ao tempo dos compostos não retidos também foram encontrados. Gosetti et al. (2007) encontraram picos similares quando extraíram selênio a partir de leveduras usando procedimento de extração e condições cromatográficas similares. Os extratos proteolíticos foram diluídos em água tipo 1 na proporção de 1:90.
0 1 2 3 4 5
Tempo (min)
Protease+SDS
Protease+SDS+Tris-HCl Protease
Protease+Lipase Protease+Tris-HCl SeMet
Figura 22 - Perfis cromatográficos das extrações proteolíticas (80Se)
Os diferentes procedimentos empregando protease tiveram eficiências de extração similares (Figura 20), mas o procedimento utilizando protease e lipase foi selecionado para as análises posteriores, pois foi o que resultou maior eficiência de extração (94 ± 6 %).
Cabe ressaltar que os brancos não apresentaram espécies de selênio detectáveis tanto para as extrações proteolíticas quanto para as extrações não proteolíticas.
Avaliação da repetibilidade do procedimento de extração da selenometionina na amostra
Doze amostras de levedura foram submetidas ao procedimento de extração selecionado (protease + lipase) para avaliar a repetibilidade da extração. A fração mássica de selenometionina foi quantificada mediante calibração externa.
A Figura 23 ilustra a fração mássica de selenometionina obtida para doze amostras que variou entre 2603 mg kg-1 e 3259 mg kg-1. As barras de erro apresentadas no gráfico representa o desvio-padrão.
2200 2550 2900 3250 3600
0 3 5 8 10 13
Fração mássica (mg kg-1 )
Amostra
Figura 23 - Fração mássica de SeMet nos extratos utilizando protease + lipase
Essa variação de fração mássica resultou em uma contribuição de 1,8 % para a incerteza associada ao procedimento de extração (ufext) o que consequentemente refletirá no grau de (não) homogeneidade do lote do futuro MRC.
Como se pretende utilizar o método analítico desenvolvido nesse trabalho nos estudos de certificação de selenometionina em um material de referência de levedura produzido pelo Labin, minimizar a contribuição das fontes de incerteza será fundamental para a melhoria da qualidade do resultado.
Variações nas condições de extração em função das posições das amostras no agitador termostatizado podem aumentar a contribuição da (não) homogeneidade do lote do MR. Por essa razão, a eficiência de extração em cada posição do agitador (Figura 24) foi avaliada utilizando 0,25 g de amostra em 5 mL de solução contendo protease (4 mg g-1) e lipase (2 mg g-1).
10
77 – 80%
81 – 84%
85 – 88%
1 2 3 4 5
85%
82%
82%
82%
88%
6 7 8 9
85%
84%
82%
87%
82%
11 12 13 14 15
85%
83%
83%
85%
82%
16 17 18 19
80%
80%
83%
83%
20 21 22 23 24
84%
85%
82%
77%
79%
25 26 27 28 29
79%
82%
78%
82%
82%
30 31 32 33 34
81%
83%
83%
82%
78%
Figura 24 - Eficiência de extração das amostras em cada posição no agitador termostatizado
As eficiências de extração variaram entre 77 % e 88 %. Com o objetivo de minimizar a variação da fração mássica de selenometionina, doze amostras (quantidade máxima de amostras previstas para os estudos de certificação – ver Tabela 40) foram submetidas novamente ao procedimento de extração usando protease e lipase, mas dessa vez nas posições do agitador que possuíam eficiências de extração similares (81 % a 84 %). A Figura 25 apresenta a posição em que as amostras foram posicionadas no agitador termostatizado (símbolo ) para realizar novamente a extração de selenometionina da amostra.
10
77– 80%
81 – 84%
85 – 88%
1 2 3 4 5
85%
82%
82%
82%
88%
6 7 8 9
85%
84%
82%
87%
82%
11 12 13 14 15
85%
83%
83%
85%
82%
16 17 18 19
80%
80%
83%
83%
20 21 22 23 24
84%
85%
82%
77%
79%
25 26 27 28 29
79%
82%
78%
82%
82%
30 31 32 33 34
81%
83%
83%
82%
78%
Figura 25 - Posições das doze amostras na repetição do procedimento de extração no agitador termostatizado
A determinação da fração mássica de selenometionina foi novamente realizada e, conforme apresentado na Figura 26, observou-se menor variação da fração mássica de selenometionina para as doze amostras colocadas nas posições do agitador termostatizado (2941 mg kg-1 e 3281 mg kg-1). A incerteza associada ao procedimento de extração da amostra (ufext) foi reduzida de 1,8 % para 1,0 % (extração das amostras colocadas nas posições do agitador termostatizado), o que representa uma redução de 44 %. Sendo assim, as posições do agitador termostatizado que possuem eficiências de extração entre 81 % e 84 % foram usadas para os estudos posteriores.
2200 2550 2900 3250 3600
0 3 5 8 10 13
Fração mássica (mg kg-1)
Amostra
Figura 26 - Fração mássica de SeMet nos extratos para as doze amostras após repetição do procedimento de extração (posições do agitador termostatizado)