Fase Sólida

envolvidos na mistura. Dezesseis dias após o início do teste, as minhocas foram recuperadas e o peso médio dos indivíduos foi determinado na pesagem em balança analítica pela diferença do peso médio inicial e final (Figura 3). O teste apresenta validade dos resultados quando a porcentagem de mortalidade observada nos controles é menor ou igual a 10%.

Figura 3: Pesagem dos organismos testes Eisenia foetida.

4.2.1.2 Fitotoxicidade

O procedimento para a realização dos ensaios foi seguindo a norma ISO 11269-2 (ISO, 1995). Os testes de fitotoxicidade clássicos foram realizados com três espécies de plantas: alface (Lactuca sativa) e brócolis (Brassica oleracea), ambas dicotiledôneas e milho (Zea mays), monocotiledônea, que além de pertencerem a classes diferentes são espécies de germinação e crescimento relativamente rápido. As sementes foram fornecidas pela empresa estatal EPAGRI (Empresa de Pesquisa Agropecuária e Difusão de Tecnologia de Santa Catarina, Florianópolis, SC). O material húmico é o mesmo usado em todos os testes de toxicidade, adquirido na Minho Húmus Ind. e Com. de Húmus LTDA, de Pomerode - SC, o qual não continha nenhuma contaminação por pesticida ou metal pesado. Este material apresentou 40% de Carbono em sua composição e apresenta-se com aspecto uniforme, inodoro, com coloração escura. Foi seco ao ar livre e usado como referência (controle) e como diluente para preparar as diluições em série do solo e do lodo agroindustrial. As concentrações testadas (6%; 12,5%; 25%; 50%; 75% e 100%) foram colocadas em potes (plástico descartável, de 15 cm de diâmetro, 15 cm de altura), em triplicatas contendo cada uma 150 g (base seca) de amostra (ou sua diluição). Dez sementes de uma só espécie foram semeadas em cada pote e água destilada foi suavemente pipetada na superfície do solo numa quantidade

equivalente a 2/3 da capacidade máxima de retenção de água da amostra (ponderação foi usada em caso de misturas). A evapotranspiração da água foi determinada por pesagem diária dos potes e esta foi compensada com a adição de água destilada. As plantas foram cultivadas sob condições controladas a uma temperatura de 20 ± 2°C, com iluminação de 60 mEm^-2s^-1 (lâmpadas fluorescentes brancas frias), sob um fotoperíodo de luz de 16h. Dezesseis dias após o plantio, as plantas foram cortadas ao nível do solo e o peso úmido médio do material vegetal foi determinado após pesagem em balança analítica.

4.2.1.3 Fitogenotoxicidade

Os testes de genotoxicidade foram realizados com sementes comerciais secas de Vicia faba (var. Aguadulce), segundo o protocolo em avaliação da ISO/WS 29200 (ISO, 2010), com pequenas modificações. As sementes foram desinfetadas com uma solução de hipoclorito de sódio a 5%, enxaguadas 4 vezes com água deionizada em seguida embebidas em água deionizada durante 24 horas para facilitar a germinação. As cascas foram retiradas e as sementes foram deixadas germinar entre duas camadas de algodão molhado a 22°C durante 3 dias. Depois de remover 3 mm das extremidades das raízes primárias as plântulas foram cultivadas no suporte sólido durante 3 dias (no caso dos testes com lixiviados, as plântulas foram colocadas em meio Hoagland durante 36 horas para desenvolver as raízes secundárias antes de serem expostas às diferentes diluições dos lixiviados). As concentrações testadas em triplicatas foram de 6%; 12,5%; 25%; 50%; 75% e 100%. As plântulas foram expostas a 25°C, com um fotoperíodo luz/escuro de 16:8 horas. Como controle positivo, foi adicionado Hidrazida Malêica (10^-5 M = 1,12 mg Kg^-1) ao húmus e como controle negativo foi usada água destilada. Para monitorar os efeitos genotóxicos do solo, lodo ou mistura de solo/lodo (e seus respectivos lixiviados) nas células das raízes de Vicia faba, as raízes secundárias foram cuidadosamente lavadas duas vezes com água deionizada e excisadas (5 raízes por plântula) e fixadas durante a noite em solução de Carnoy (25% de ácido acético glacial: etanol a 75%, v:v) a 4°C ou armazenadas, quando necessário, em Etanol a 70% a 4°C, no escuro para posterior observação. Em seguida, as pontas de raízes foram hidrolisadas em 1 N HCl a 60°C durante 6 minutos, excisadas nas zonas meristemáticas (1 mm a partir da extremidade), colocadas sobre lâminas de vidro, coradas com 1% de solução de aceto-orceína e comprimida entre a lâmina e uma lamela. A frequência de micronúcleos e do índice mitótico foram avaliadas a partir de 1.000 células por ponta da raiz sob um microscópio com uma ampliação de 400X. Ao mesmo tempo, o número de células em mitose foi anotado. A relação entre o

número de células em mitose e o número total de células é chamada de índice mitótico (IM) e é um indicador de citotoxicidade. Duas lâminas foram preparadas para cada uma das três repetições e um total de 6000 células foram analisadas por grupo experimental. As lâminas foram codificadas por uma terceira pessoa para evitar indução nas contagens em função da amostra analisada.

4.2.1.4 Atividade da Peroxidase

A determinação da atividade enzimática da peroxidase nos vegetais: Alface (Lactuca sativa); Brócolis (Brassica oleracea) e Milho (Zea mays), assim como nas espécies vegetais nativas - Pitanga (Eugenia uniflora); Tucaneira (Aegiphila sellowiana); Ingá (Inga spp);

Aroeira-vermelha (Schinus terebinthifolius) e Cerejeira (Prunus cerasus) foi avaliada segundo a metodologia proposta por Byl et al. (1994) macerando 0,1 g da amostra (folhas ou raízes), colhidas de forma homogênea, com 2 mL de solução tampão fosfato de potássio 50 mM (pH

= 7,6). O homogeneizado foi transferido para microtubos tipo Eppendorf graduado com tampa e centrifugados (10.000 g, 10 min., 4ºC) na centrifuga Mini Spin Plus - Eppendorf. As amostras ficaram armazenadas em freezer (-20°C) até o momento das análises. Para a análise, 0,1 mL do sobrenadante obtido contendo enzima foi adicionado a 0,70 mL da solução A e 0,75 mL da solução B. A solução A foi constituída por 125 mg de 4-Aminoantipireno e 4,05 g de fenol completando com 250 mL de água destilada. A solução B é constituída de 0,1 mL de Peróxido de Hidrogênio e 250 mL de tampão HEPES 0,01 M, pH = 7,1. O sistema de reação foi mantido a temperatura ambiente, sendo realizada a leitura no espectrofotômetro digital Instruthem Modelo UV-2000A em comprimento de onda igual a 510 nm. A cinética durou 1 minuto. A atividade da enzima é a diferença entre as leituras final e inicial e esta variação foi expressa em função da quantidade de proteínana amostra (unidades específicas/mg proteína), onde uma unidade específica corresponde a uma variação da absorbância de 0,1 unidades.

Foram realizadas três repetições para cada amostra.

4.2.1.5 Dosagem de Proteínas Totais

A dosagem de proteínas totais nas raízes e folhas da Vicia faba foi realizada segundo o método de Bradford (1976), utilizando o reagente azul brilhante de Coomassie G-250. Para a preparação do reagente, foram dissolvidos 100 mg de azul brilhante de Coomassie G-250 em 50 mL de Etanol 95% (v/v). Após a dissolução, foram adicionados 100 mL de Ácido

Fosfórico 85% (v/v). O volume foi completado para 1 litro com água destilada e após a solução foi filtrada e conservada em frasco âmbar. Dos extratos obtidos previamente (vide seção 4.2.1.4) foi utilizada uma alíquota de 100 µL (ou uma diluição para cair na parte linear da curva-padrão), a qual foi adicionado 3 mL do reagente de Coomassie, sendo agitados em seguida. O sistema de reação foi mantido a temperatura ambiente e realizada a leitura de absorbância após 3 min. no espectrofotômetro em comprimento de onda igual a 595 nm.

Foram realizadas três repetições em cada amostra. A absorbância foi relacionada com a quantidade de biomassa presente na amostra e as quantidades de proteína foram calculadas em relação à curva-padrão feita com soro de albumina bovina.