A análise proteômica envolve a avaliação em larga escala de proteínas incluindo suas interações, localizações, funções e possíveis modificações. O desenvolvimento das técnicas de espectrometria de massas possibilitou a identificação e caracterização de proteínas e seu constante aperfeiçoamento permite uma maior qualidade dos resultados obtidos principalmente quanto a resolução, sensibilidade e rendimento (COIRAS et al., 2008).
A utilização da técnica de gel bidimensional (2DE), com inúmeras proteínas diferencialmente expressas sendo identificadas, tem sido feita com sucesso em estudos envolvendo a resposta de fungos a drogas. Apesar do desenvolvimento de técnicas de maior rendimento, diversos estudos baseados em géis bidimensionais continuam bastante responsivos.
Diversos estudos têm sido realizados buscando identificar proteínas diferencialmente expressas em micro-organismos relacionadas a etapas do desenvolvimento, resposta a drogas, proteínas de parede celular, dentre outras. Groot et al. (2004) analisaram proteínas ligadas a parede celular de Candida albicans e, utilizando espectrometria de massas, identificaram 14 que foram divididas em cinco catergorias funcionais: 5 enzimas relacionadas a carboidratos, 2 proteinas de adesão, 2 semelhantes a superóxido dismutase que parecem estar envolvida na neutralização de reposta de defesa do hospedeiro; e as 5 restantes com função desconhecida. Singh et al. (2012) avaliando a resposta de defesa de Aspergillus fumigatus quando tratado com
29 coumarina, um potente antifúngico, identificaram 143 proteínas diferencialmente expressas, sendo 13 super-expressas e 96 reprimidas. As proteínas encontradas estavam envolvidas no controle da divisão celular, ubiquitinação, ATP sintase vacuolar do tipo A, dentre outras.
Mares (2012) avaliou as proteínas expressas em M. perniciosa durante a germinação dos esporos nos períodos de 0, 2 e 4 horas através de 2D-PAGE combinada à Espectrometria de Massa (ms/ms), e observou 514, 434 e 508 spots, respectivamente, n o s p e r ío d o s a va l ia d o s. Fo r a m i d e n tif ica d a s 168 proteínas das quais, no período de 4h, foram relacionadas ao metabolismo energético essencial ao processo de diferenciação hifal. Nos períodos de 2 e 4 horas foram expressas principalmente proteínas associadas a síntese proteica (MARES, 2012). Lopes et al., (2008) caracterizaram rotas metabólicas exclusivas do fungo no momento da interação como a rota da quitina. Alvim et al. (2009) analisaram proteínas secretadas relacionadas com a morfologia da hifa.
A identificação de proteínas do fungo expressas em resposta a drogas, como TcPR-10, podem fornecer informações importantes sobre o papel que desempenham no processo de resposta de defesa do fungo.
6. Saccharomyces cerevisiae: Transporte ABC, formação de vacúolos e autofagia
Saccharomyces cerevisiae foi o primeiro organismo eucariótico completamente sequenciado, anotado, e disponibilizado ao público.
(GOFFEAU et al., 1997). Além de sua importância industrial, S. cerevisiae serve como um organismo modelo para a compreensão da função de células eucarióticas. Seus genes, distribuídos em 16 cromossomos, apresentam grande homologia com genes eucariotos sendo, inclusive, capazes de complementar sua função (BOTSTEIN, CHERVITZ e CHERRY, 1997;
FRIEDBERG, 2006). Dentre os genes de S. cerevisiae destacamos aqueles de
30 interesse nesse esudo: transporte do tipo ABC, autofagia e formação de vacúolos.
Transportadores de membrana do tipo ABC
O transportadores do tipo ABC são uma superfamília de proteínas que inclui membros importadores e exportadores. Estas proteínas convertem a energia obtida pela hidrólise de ATP em um movimento trans-bicamada levando ao transporte de substratos para dentro do citoplasma (Importação) ou para fora (Exportação). Os importadores foram encontrados apenas em procariotos, até o momento, enquanto as proteínas exportadoras são expressas em todos os reinos (GOTTESMAN e AMBUDKAR, 2001).
Transportadores ABC estão envolvidos em vários processos celulares como manutenção da homeostase osmótica, processos anti-envelhecimento, divisão celular, resistência a drogas, patogênese e esporulação, tráfico de colesterol e lipídeos dentre outros (GEORGE e JONES, 2012). Além destes existem os transportadores envolvidos com o efluxo de substâncias nocivas a célula realizando um processo de detoxificação celular através de diferentes proteínas cuja superexpressão indica a resistência a drogas. Pohl et al. (2012) analisaram uma população de carrapatos Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Jaguar) resistente a quatro classes de acaricidas. Foi identificado um mecanismo de desintoxicação baseado em transportadores ABC sugerindo que estas proteínas atuam na proteção contra vários tipos de acaricidas e apresentam um importante papel para o desenvolvimento de futuros fármacos.
A levedura S. cerevisiae contém mais de 30 genes do tipo ABC (DECOTTIGNIES e GOFFEAU, 1997; BAUER; WOLFGER; KUCHLER, 1999) dentre os quais destacam-se os genes da subfamília PDR (Resistência Pleiotrópica a Drogas) que codificam para uma complexa rede de reguladores de transcrição que controlam a expressão de algumas bombas de efluxo de drogas (WOLFGER; MAMNUN; KUCHLER, 2001). A deleção de transportadores de membrana nas linhagens mutantes de S. cerevisiae é uma importante ferramenta para identificação de vias de eliminação de substancias como, por exemplo, compostos antifúngicos e antibióticos.
31
Tabela 2. Descrição de bombas de efluxo de drogas da família ABC encontradas em Saccharomyces cerevisiae (Adaptado de PAUMI et al., 2009)
Transportador ORF Localização Descrição
PDR5 YOR153w Membrana plasmática
Transporte múltiplo de drogas envolvidas na resistência a compostos xenobióticos;
transporte de cálcio e esteróis
PDR15 YDR406w Membrana plasmática
Transporte de múltiplas drogas envolvido na resposta geral ao estresse para detoxificação celular
PDR10 YOR328w Membrana plasmática
Transporte de múltiplas drogas envolvido na rede de resistência de drogas pleiotrópicas
SNQ2 YDR011w Membrana plasmática Transporte de múltiplas drogas envolvido na resistência a ROS
PDR18 YNR070w Membrana plasmática
Provável transporte que implica na resistência de drogas pleiotrópicas
PDR12 YPL058c Membrana plasmática
Transporte de múltiplas drogas envolvido na resistência a ácidos organicos.
PDR11 YIL013c Membrana plasmática
Transporte de múltiplas drogas envolvido na rede de resistência a drogas e absorção de esteróis AUS1 YOR011w Membrana plasmática Envolvido com a absorção de
esteróis YOL075c YOL075c Membrana plasmática Desconhecido
ADP1 YCR011c Membrana plasmática Desconhecido
32 Autofagia
A autofagia (ATG) refere-se a um sistema intracelular de degradação celular que envolve a entrega de compostos celulares para o lisossomo/vacúolo. As subunidades geradas após degradação são então reaproveitadas pela célula, estabelecendo assim uma via de retroalimentação que permite a manutenção da homeostase (YORIMITSU et al., 2007; WANG;
KLIONSKY, 2011).
Foram identificados três tipos de autofagia: Mediada por chaperonas, microautofagia e macroautofagia, que diferem entre si quanto a suas funções fisiológicas e o modo de entrega. Na autofagia mediada por chaperonas, proteínas malformadas são marcadas por chaperonas, como hsp70, e enviadas diretamente para o lisossomo; A microautofagia consiste na degradação de componentes celulares que são diretamente encaminhados ao lisossomo e então internalizados por invaginação ou protrusão da membrana do lisossomo.
Finalmente, a macroautofagia é caracterizada pelo isolamento do material a ser degradado em uma estrutura dupla membrana denominada autofagossomo, também chamado vacúolo autofágico, que se fusiona ao lisossomo, formando o autolisossomo (Figura 4) (BAEHRECKE, 2005).
O processo autofágico engloba a atuação de 36 proteínas descritas até o momento, que interagem nas diferentes etapas da rota autofágica. Estudos de fracionamento celular demonstraram que ATG8 é a principal proteína do processo de autofagia por estar envolvida no transporte de lipídeos até a membrana em expansão e estar ligada ao processo de fechamento da membrana. Mutantes para o gene .ATG8 são incapazes de gerar autofagia (KIRISAKO et al., 1999). Desta forma a utilização da proteína ATG8 é uma alternativa para o estudo da dinâmica de membrana durante autofagia.
Pereira (2012) utilizou S. cerevisiae para caracterização da proteína Atg8 para observar a resistência em diferentes concentrações de tunicamicina (0, 0,2, 0,4 e 0,8 ug / mL) e ditiotreitol (0, 2, 4 e 6 mM / mL) em duas fontes de carbono (glucose e glicerol), e determinar o perfil de crescimento dos isolados quando cultivados em glucose e glicerol, a produção da espécies reativas a oxigênio (ROS) e formação do autofagossomo. Foram testadas quatro linhagens isogênicas de S. cerevisiae: (A) selvagem (Atg8), (B) selvagem contendo uma
33 cópia do gene ATG8 de M. perniciosa, (C) mutante atg8Δ (gene Atg8 de S.
cerevisiae ausente) contendo uma cópia do gene de ATG8 de M. perniciosa e (D) atg8Δ mutante. Os resultados obtidos apresentaram diferença fenotípica entre DXA, DxB e CXD, bem como similaridade de C entre A e B, indicando uma expressão heteróloga possível da proteína MpAtg8 (Proteína Atg8 de M.
perniciosa).
Figura 4. Representação esquemática das etapas relacionadas as rotas autofágicas. Macroautofagia (01) Início da formação da membrana de isolamento (IM). (02) IM totalmente formada originando o autofagossomo que contém os compostos a serem degradados, (03) formação do autofagolisossomo através da fusão entre o autofagossomo e o lisossomo, (04) digestão dos componentes citoplasmáticos via hidrolases lisossomais, (5) Autofagia mediado por chaperones, (6) microautofagia. (Adaptado de He e Klionsky, 2009).
34 Os genes envolvidos no processo de autofagia estão presentes em micro-organismos, plantas e animais, e alguns genes autofágicos (ATGs) conhecidos são bastante conservados nestes grupos. Estes genes atuam na regulação das vias autofágicas dentre os quais destaca-se o ATG8 (KIEL, 2010).
Poucos estudos têm sido realizados visando observar autofagia em fungos filamentosos, como M. perniciosa. Pungartnik et al., (2009) demonstraram que ocorre uma indução transitória do gene MpATG8 em resposta a estresse oxidativo, assim como foi observado uma variação da indução de acordo a fonte de carbono utilizada para crescimento, sendo que, durante as diferentes fases do ciclo de M. perniciosa houve uma expressão continua da proteína Atg8.
Em S. cerevisiae a proteína Atg8 apresenta 117 aminoácidos que atuam no início da formação e expansão da IM. Para que ocorra a expansão da PAS e consequentemente formação da IM e do autofagossomo, lipídeos devem ser incorporados a estrutura em formação. Para essa adição ser realizada, faz-se necessário o transporte dos lipídeos até o local de fixação, e este transporte é efetuado via Atg8p (KIRISAKO et al., 1999; 2000; XIE et al., 2008). Sendo que o tamanho do autofagossomo formado será proporcional a quantidade de Atg8p (XIE et al., 2008). Além de estar envolvido no transporte de lipídeos até a membrana em expansão, estudos de fracionamento celular também demonstraram que Atg8p é a principal proteína do processo de fechamento da membrana (KIRISAKO et al., 2000). Em conjunto, estas características tornam Atg8p uma ferramenta chave para analisar a dinâmica da membrana durante o processo autofágico.
Sistema vacuolar
O vacúolo é um compartimento acídico importante para células fúngicas por estar diretamente envolvida com a fisiologia desses organismos. Entre as muitas funções desta organela estão a manutenção do pH e osmorregulação, a degradação de proteínas, esporulação, reciclagem de proteínas armazenamento de aminoácidos, transporte de íons, dentre outros. O vacúolo
35 atua na hidrólise como no lisossomo de mamíferos, e na homeostase, armazenamento e osmoregulação semelhante ao que ocorre nas plantas (KLIONSKY, HERMAN e EMR, 1990; TETER e KLIONSKY, 2000).
A biogênese do vacúolo envolve diferentes vias incluindo (i) a triagem das proteínas vacuolares à distância do local de entrega (ii) a endocitose de material a partir da membrana plasmática, (iii) segmentação do citoplasma evitando estágios iniciais da via secretora, e (iv) a herança de material de vacuolar por células filhas durante a divisão celular (Figura 5).
Defeitos nos vacúolos causados pela exposição a drogas levam a acidificação e incapacidade desta organela em executar suas funções como por exemplo incapacitando o organismo de responder ao stress osmótico e incapacidade de degradar e reciclar componentes celulares danificados podendo, desta forma, causar sensibilidade aumentada a drogas (MARKOVICH et al., 2004).
Figura 5. Transporte de proteínas para o vacúolo em leveduras. 1. (a) Complexo de Golgi através de um compartimento pré-vacuolar (PVC) e (b) através de um percurso alternativo; 2. endocitose de proteínas da superfície celular; 3. via biossintética vacuolar; 4. autofagia; 5. Fusão celular (BRYAN e STEVENS, 1998)
36 III. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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