Tabela 10: Meio de cultivo agar manitol
Componente Quantidade
Peptona de carne 10,0
Extrato de carne 1,0
D-manitol 10,0
Cloreto de sódio 75,0
Vermelho de fenol 0,025
Agar 15,0
pH 7,0
b. Isolamento e cultura pura de Staphylococcus aureus
Com auxílio de swab estéril, foram coletadas amostras da mucosa nasal de 10 alunos do curso técnico de Química e inoculadas por técnica de semeadura simples em placas de Petri contendo agar manitol. O procedimento foi realizado sob condições assépticas próximo da chama do bico de Bunsen.
As placas foram encubadas a 37º C por 24 horas em estufa bacteriológica marca olidef cz. Após este período as placas foram observadas próximas da chama do bico de Bunsen e as colônias típicas de Staphylococcus aureus foram então transferidas com auxílio da alça de nichrome para tubo de ensaio contendo caldo glicosado estéril. Os tubos foram incubados a 37º C sob agitação de 170 rpm por 24 horas. As culturas puras obtidas de Staphylococcus aureus foram utilizadas para os testes com as amostras para avaliar o efeito antimicrobiano (figura 4).
Figura 4. Cultura de Staphylococcus aureus em caldo glicosado, 37º C, 24 horas,
170 rpm.
c. Preparo das amostras a serem testadas como agentes antibacterianos
Para realizar o teste de formação de halos de inibição em placa, as amostras utilizadas foram as seguintes (Figura 5):
• Álcool iodado (polvidine);
• Hidrogel com Alginato 0,9% (Água, Alginato de Cálcio e Sódio, Carboximetilcelulose ,propilenoglicol e imidazolidiniluréia);
• Ácidos Graxos Essenciais (AGE) – Dersani;
• Cloridrato de Lidocaína, spray antisséptico Hertz;
• Extrato de própolis, spray, marca VITAN;
• Infusão de arnica;
• Extrato de alho (2g/L) em álcool etílico;
• Sal de cozinha,
• Açúcar cristal.
Figura 5. Amostras utilizadas para teste antibacteriano. 1. Açúcar cristal. 2. Placa de Petri com discos de papel de filtro embebidos em solução de extrato de alho (2g/L) e álcool etílico. 3. Extrato de Própolis spray, marca VITAN. 4. Ácidos Graxos Essenciais (AGE) – Dersani . 5. Cloridrato de Lidocaína, spray antisséptico Hertz. 6. Álcool iodado, da marca Iodolfa. 7. Folhas de arnica para preparo de infusão. 8. Hidrogel com alginato.
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Preparo da infusão de arnica: levou-se ao fogo, 200mL de água destilada até a ebulição. Após a fervura e retirou-se do fogo, em seguida, foram adicionadas 3 folhas de arnica e o recipiente foi fechado.
d. Preparo dos discos de papel de filtro
Folhas de papel de filtro foram perfuradas com auxílio do cortador de folhas de tal maneira que discos circulares eram obtidos com diâmetro de 5 mm. Os discos foram armazenados em placas de Petri e esterilizados em forno Pasteur 165º C por 90 min, marca olidef cz (figura 6).
Figura 6: discos de papel de filtro esterilizados em Forno Pasteur (165º C/90min).
e. Teste do efeito antimicrobiano das amostras
As placas de Petri contendo agar para contagem de microrganismos foram divididas em quatro quadrantes com auxílio da caneta de retroprojetor e em seguida foram numerados, figura 7. Cada divisão recebeu o nome e numeração do agente antimicrobiano correspondente.
Figura 7. Placas de Petri contendo agar para contagem de microrganismos com divisões em quatro quadrantes.
Após separar todo o material a ser utilizado na experiência, deu-se início a inoculação das culturas de Staphylococcus aureus em placas de agar para Contagem de Microrganismos, (figura 8).
Após desenvolvimento dos microrganismos no caldo glicosado, foi retirado um inóculo com auxílio do swab estéril da cultura de Staphylococcus aureus para placa de Petri contendo agar para contagem de microrganismos. A técnica de inoculação foi feita por semeadura simples sob condições assépticas próximas a chama do bico de Bunsen. Este procedimento foi feito em oito placas contendo o agar citado acima.
Figura 8. Coleta da bactéria Staphylococcus aureus cultivada em caldo glicosado.
Figura 9. Semeadura de Staphylococcus aureus em placa com meio de Agar para Contagem de Microrganismos.
Em seguida, após inocular a bactéria (figura 9), pegou-se um disco de papel de filtro estéril com a pinça, e este foi mergulhado no agente para teste antibacteriano e em seguida, foi depositado nas placas, no local identificado com sua numeração e nome. O procedimento foi repetido para os agentes antimicrobianos Álcool iodado, hidrogel com alginato, ácidos graxos essenciais (AGE), cloridrato de lidocaína, extrato de própolis, infusão de arnica, extrato de alho.
As quatro placas sem divisões seguiram o mesmo procedimento até a inoculação da bactéria Staphylococcus aureus. O açúcar cristal foi esterilizado no fluxo laminar Pachane por 15 minutos com lâmpada ultra-violeta (figura 10) Para adicionar o sal de cozinha e o açúcar cristal para a realização do teste, pegou-se uma colher de chá esterilizada para a transferência do açúcar para a superfície do agar para contagem de microrganismos, imediatamente após a inoculação da bactéria (figura 11). Para semear o sal, pegou-se uma outra colher de chá esterilizada e seguiu-se o mesmo procedimento. Identificou-se duas placas para o açúcar e duas para o sal. A inoculação foi realizada em capela de fluxo laminar.
Figura 10. Placas de Petri contendo meio de cultivo de Agar e açúcar cristal sobre papel de filtro no fluxo laminar com a lâmpada UV ligada.
Figura 11. Inoculação do açúcar cristal em placa de Petri contendo agar para contagem de microrganismos inoculado com Staphylococcus aureus
Após tais procedimentos, as placas foram incubadas em estufa bacteriológica a 37°C, por 48 horas (figura 12).
Figura 12. Placas de Petri contendo agar para contagem de microrganismos. O meio de cultivo foi inoculado com Staphylococcus aureus e neste meio foram inseridas as amostras a serem testadas quanto ao efeito antibacteriano. As placas foram incubadas a 37 °C por 48 horas.
Após completar o tempo de incubação, as placas foram observadas quanto a formação de halos de inibição pelo efeito antibacteriano das amostras testadas (figura 13 ).
Figura 13. Placas de petri contendo cultura de Staphylococcus aureus de 48 horas de crescimento, utilizadas para o teste de formação de halo de inibição.
A intenção do cultivo bacteriano em placa de Petri contendo agar para contagem de microrganismos inoculado com Staphylococcus aureus e açúcar cristal era verificar o efeito de um ambiente hiperosmótico sobre o crescimento bacteriano. Para que o aluno pudesse entender como isto acontece, elaborou-se
um pequeno experimento a fim de representar macroscopicamente o que ocorre com a bactéria em ambiente hiperosmótico.
2.2- Experiência 2- representação da morte bacteriana decorrente da hiperosmose, causada pelo açúcar.
Em um copo de vidro adicionou-se vinagre e um ovo de codorna. O volume de vinagre foi o suficiente para cobrir todo o ovo. O ovo permaneceu no recipiente com vinagre por 24 horas, até que toda sua casca calcária fosse removida. Em seguida, o ovo foi removido com cuidado do copo e lavado com água corrente.
Foi preparada uma solução concentrada de açúcar. Foram adicionados 250 mL de água corrente a um recipiente de alumínio e acrescidas 6 colheres de sopa de açúcar. A solução foi aquecida até a formação de uma calda doce, viscosa levemente amarelada.
O ovo de codorna sem casca foi adicionado a um recipiente de vidro e em seguida, lentamente foi acrescida a calda de açúcar. O ovo foi mantido nesta condição por 72 horas.
2.3- Elaboração de um work shop intitulado: As infecções no ensino de Bioquímica
Foi elaborado um work shop, sob a orientação da professora de Prática Pedagógica do CEFET Campos, do 8º Período das Licenciaturas de Química, Física e Biologia, para ser apresentado a professores do Ensino médio que atuassem na cidade de Campos dos Goytacazes, nas áreas de ensino em Ciências Química e Biológica. O tema teve como título: As infecções no ensino de Bioquímica - um conteúdo interdisciplinar (anexo 1).
O work shop teve como objetivo principal a formulação de um tema interdisciplinar, com conteúdos significativos para os alunos por sua contextualidade. O tema foi apresentado através de experimentos a fim de demonstrar o quanto se pode enriquecer uma aula bem como facilitar a
compreensão do assunto.
Para o work shop, foram apresentados alguns dos resultados obtidos com as experiências realizadas em laboratório: placas de Petri com formação de colônias de bactérias do tipo Staphylococcus aureus, placas de Petri com formação de halos que demonstravam a eficiência de alguns medicamentos no combate às infecções em feridas e um copo com uma célula macroscópica (ovo de galinha) que após 8 dias mergulhado em solução açucarada, demonstrou o efeito hiperosmótico do açúcar sobre a bactéria.
A princípio, o tema foi apresentado a um grupo de 16 pessoas, porém apenas 6 eram professores de Química (3) e de Biologia (3). A apresentação do work shop foi feita no Centro de Controle de Zoonoses de Campos (CCZ).
Como o objetivo era de levantar mais dados a respeito do tema, foi elaborado um questionário (anexo 2) e este foi submetido aos professores presentes que eram das áreas de Química e de Biologia (6 ao todo). Nesse questionário foram feitas dez perguntas, onde se pretendeu analisar a opinião desses profissionais da educação em relação ao tema.
Como não foi satisfatório o número de questionários preenchidos, outros 9 questionários foram passados no IFF-Campos. Desta vez a apresentação do tema fora feita individualmente, relatando-se o objetivo, a justificativa (documento que segue em anexo), bem como os experimentos e a finalidade de cada um deles.
Após a apresentação do tema, os questionários foram preenchidos pelos professores.
3 – RESULTADOS E DISCUSSÕES
3.1- Experiência 1 – utilizando o método de difusão em discos e semeadura direta do sal de cozinha e do açúcar cristal sobre a placa de Petri contendo cultura de Staphylococcus aureus em agar para contagem de microrganismos, para verificar a eficácia de alguns agentes no combate à bactéria do tipo Staphylococcus aureus.
A placa de Petri contendo agar para contagem de microrganismos, cultura semeada de Staphylococcus aureus e o sal de cozinha foi observada para avaliação do efeito antimicrobiano do sal. Houve formação de halo de inibição na região na qual o sal foi depositado, resultado que sugere efeito antimicrobiano deste composto, figura 14.
Figura 14. Halo de inibição formado pela ação do sal de cozinha sobre cultura de Staphylococcus aureus em agar para contagem de microrganismos.
Segundo Gava (1984), a atividade antimicrobiana do sal está relacionada com sua habilidade em reduzir a atividade de água, e isto influencia o crescimento microbiano. O sal tem as seguintes características: produz um efeito osmótico, limita a solubilidade do oxigênio, modifica o pH; os íons de sódio e cloro são tóxicos, e o sal contribui para a perda de íons de magnésio.
Na figura 15, pode-se observar a formação de halos de inibição nas regiões numeradas com 1,3 e 4 que compreendem respectivamente a álcool iodado, extrato de própolis e cloridrato de Lidocaína. A região 2 corresponde ao extrato de alho, resultado que sugere que este material não exerce efeito sobre o crescimento e reprodução do Staphylococcus aureus.
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Figura 15. Placa de petri contendo agar para contagem de microganismos inoculada com Staphylococcus aureus. 1. Halo de inibição formado pelo efeito do álcool iodado, 2. Ausência de halo de inibição do extrato de alho. 3. Halo de inibição formado pela ação do extrato de própolis, 4. Halo de inibição formado devido à ação do cloridrato de Lidocaína.
Filho et al. (2008) verificaram que o extrato de própolis é um bom antimicrobiano pois este apresentou excelente atividade antimicrobiana, sendo maior que hipoclorito de sódio a 5%, entretanto, o gel de clorexidina foi o mais efetivo contra Enterococcus faecalis. A própolis tem atividade antibiótica, cicatrizante (AGOSTINI et al., 1997), antiinflamatória, antioxidante (PARK et al., 1998), antiviral, anestésica (MANARA et al., 1999), antifúngica (MARTINS et al., 2002; OLIVEIRA et al., 2006), amebicida (SANTOS & ZAIA, 2002), antiulcerogênica (ARAÚJO et al., 2002), antitumoral, antiséptica (GARCIA et al., 2004), antibacteriana (FERREIRA, 1999; KOO et al., 2002; DOS SANTOS, 2003;
COELHO et al., 2004; VARGAS et al., 2004) e anticariogênica (ALMEIDA et al., 2006), além de possuir biocompatibilidade (ARAÚJO et al., 2001).
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O trabalho de Marchiori (s.d.) discute que o alho possui importante ação antimicrobiana, que inicialmente foi descrita por Pasteur. Em 1944 Cavallito e Bailey testaram a ação bactericida da alicina, com efeitos positivos na inibição do crescimento de várias bactérias, tanto gram positivas quanto gram negativas. Os estudos in vitro mostram que o alho age contra vírus, bactérias e fungo. Já com relação ao álcool iodado, o trabalho de Cardoso (2001) revelou que o álcool iodado nas concentrações de 0,3%, de 1%, de 2% e de 3% destruiu, em 1 minuto, as células bacterianas aderidas à superfície dos cones de guta-percha, mas não eliminou os esporos em 15 minutos de exposição. Em relação ao cloridrato de lidocaína (oxitetraciclina), a Anvisa descreve que este tem ação principalmente bacteriostática e acredita-se que seu efeito antimicrobiano seja devido a inibição da síntese protéica. A oxitetraciclina é ativa contra um grande número de microrganismos Gram-negativos e Gram-positivos. Os componentes da classe das tetraciclinas possuem espectro antimicrobiano muito similar, sendo comum a existência da resistência cruzada entre eles.
Na próxima figura 16, pode-se observar que a região 3 identificada na figura não mostra halo de inibição do extrato de alho sobre a cultura de Staphylococcus aureus utilizada. Os demais materiais utilzados apresentaram halos de inibição, sendo que o maior halo de inibição formado foi devido ao efeito do álcool iodado.
Figura 16. Placa de Petri contendo agar para contagem de microrganismos inoculada com Staphylococcus aureus. 1. Halo de inibição formado pelo efeito do extrato de própolis. 2. Halo de inibição formado pela ação da infusão de arnica. 3.
Ausência de halo de inibição formado pela ação do extrato de alho. 4. Halo de inibição formado devido à ação do álcool iodado.
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Em relação à Solidago sp. (arnica) não foram encontrados estudos farmacológicos relacionados a efeito cicatrizante. Solidago sp., apesar de não ter comprovação científica sobre a eficácia e segurança do seu uso, é utilizada com base na tradição popular de maneira crescente, sendo atribuídas às suas preparações caseiras qualidades de medicação amarga, estomáquica, adstringente, cicatrizante e vulnerária, isto é, curativa de feridas e chagas. É empregada externamente no tratamento de ferimentos, escoriações, traumatismos e contusões (LORENZI & MATOS, 2008). Arctium lappa é conhecida na medicina popular desde a antiguidade, devido às ações bactericida e antimicótica, o que a torna um remédio eficaz contra inúmeras doenças de pele, como dermatoses úmidas e purulentas, acnes, eczemas, pruridos, seborréia da face ou do couro cabeludo e herpes simples (LORENZI & MATOS, 2008).
Na figura 17, observou-se a ausência de halo de inibição devido ao efeito da infusão de arnica sobre a cultura de Staphylococcus aureus mas é possível observar que os materiais cloridrato de Lidocaína que está na região 1 da placa, extrato de própolis que está na região 3 e O AGE (Dersani) que está na região 4 formaram halo de inibição. O material que apresentou maior halo de inibição foi o cloridrato de lidocaína.
Figura 17. Teste de efeito antimicrobianos de materiais sobre cultura de Staphylococcus aureus em agar para contagem de microrganismos. 1.Halo de inibição formado devido ao efeito do cloridrato de Lidocaína 2. Ausência de halo de inibição devido ao efeito da infusão de arnica 3. Halo de inibição formado devido à ação do extrato de própolis e 4. Halo de inibição formado pela ação do AGE (Dersani).
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O trabalho de Quege et al. (2008) Concluiu que na análise in vivo o Dersani® apresentou efeito antimicrobiano positivo sobre Enterobacter aerogenes e o Biocure® sobre Pseudomonas aeruginosa. Na análise, in vitro observou-se ausência de atividade de ambos os produtos sobre os microrganismos isolados nas lesões. Tendo em vista que vários autores alertam que nem sempre a antibioticoterapia sistêmica seja a melhor solução na abordagem de feridas crônicas infectadas, a busca de outras possibilidades, que não favoreçam a resistência microbiana representa um desafio.
O resultado a seguir mostra a formação de halo de inibição do açúcar cristal utilizado sobre a cultura de Staphylococcus aureus, na região 1 da placa de Petri, também é possível observar na região 2 o efeito do hidrogel de alginato sobre a cultura, também apresentando halo de inibição. Tanto o açúcar quanto o hidrogel foram adicionados diretamente sobre a cultura sem uso de discos de papel como suporte.
Figura 18. Teste antimicrobiano de materiais sobre cultura de Staphylococcus aureus em agar para contagem de microrganismos. 1. Halo de inibição formado pela ação do açúcar cristal e 2. Halo de inibição formado pela ação do hidrogel de alginato.
Para as feridas com infecção destacam-se os curativos de alginato de cálcio, carvão e prata e hidrofibra e prata.
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O curativo de alginato de cálcio é usado há cinqüenta anos no tratamento de ferida (HEENAN, 1998). Esse curativo é derivado de alga, é biodegradável, pode ser encontrado na apresentação de cordão ou placa de consistência frouxa e tem sido aplicado com sucesso para limpar uma ampla variedade de lesões secretantes. Esse curativo é muito útil para feridas de moderado a intenso exudato (HEENAN, 1998).
O curativo de alginato de cálcio faz parte do grupo hidrogel e é altamente absorvente. A alta absorção é obtida pela formação de um forte gel hidrofílico que limita as secreções da ferida e minimiza a contaminação bacteriana. O alginato mantém um microambiente fisiologicamente úmido que promove a cicatrização e a formação de tecido de granulação (HEENAN, 1998).
Desde o século XIX, o nitrato de prata era utilizado com dois principais propósitos: diminuir o tecido de granulação hipertrófico, para permitir a epitelização, e formar crosta na superfície da lesão, pois, assim, acreditavam que reduziriam o tempo de cicatrização de áreas enxertadas, de lesões e queimaduras extensas (KLASEN, 2000).
Em sua forma pura, a prata é inativa, entretanto reage com ácidos concentrados, produzindo sais iônicos, como os halóides de prata. Em soluções aquosas, os sais de prata liberam prata catiônica (+). Essa prata iônica é que possui atividade antimicrobiana eficaz contra uma ampla variedade de bactérias (HOLLINGER, 1996). A prata iônica é um agente antimicrobiano de amplo espectro, portanto todos os curativos com prata iônica possuem, potencialmente, um amplo espectro de ação. Não obstante, o efeito variável dos diferentes curativos que contêm prata é determinado pela maneira como essa está disponível no curativo. Alguns liberam quantidades mínimas de prata, outros liberam doses excessivas, mas não conseguem manter o fornecimento por todo tempo (HOLLINGER, 1996).
Pode-se dizer que ocorre a interação da prata com o exsudato. Os íons de sódio do exsudato substituem os íons de prata do curativo. Em um ambiente úmido, a prata estará sempre disponível para destruir as bactérias. A liberação da prata é possível mediante dois mecanismos: a concentração de cátions (+) na ferida e a formação do gel coeso que evita a liberação de doses excessivas e
repentinas da prata. À medida que os íons de prata vão efetuando sua ação antimicrobiana, eles são substituídos por novos íons de prata presentes no curativo (VLOEMAS et al., 2001).
Há falta de pesquisa clínica satisfatória para avaliar a eficácia de produtos para ferida, portanto são necessários mais estudos para avaliar as propriedades dos curativos e para melhor entender como vários curativos afetam a bioquímica da ferida. No estudo em questão, o uso de hidrofibra e prata foi eficaz no tratamento de ferida com infecção.
2.2- Experiência 2- representação da morte bacteriana decorrente da hiperosmose, causada pelo açúcar.
Foi possível observar que imediatamente após a inserção do ovo de codorna no copo com vinagre pode-se observar o ataque do ácido acético presente no vinagre sobre a superfície calcária da casca do ovo com desprendimento de gás (figura 19).
Figura19. Ação do vinagre sobre a casca do ovo de cordona com desprendimento de gás.
O ovo foi mantido no vinagre por 24 horas e após este período foi lavado e fotografado. Pode-se observar que o ovo sem a casca possui maior volume que o ovo contendo a casca (figura 20).
Figura 20. Ovo de codorna. 1. Ovo de codorno com casca. 2. Ovo de codorna com a casca removida devido ao efeito do vinagre (24 horas depois).
A casca do ovo é formada, em grande parte, de carbonato de cálcio (CaCO3). Quando se coloca o ovo em contato com o vinagre, observa-se a evolução de gás carbônico devido à seguinte reação:
2H+(aq) + CaCO3(s) → CO2(g) + H2O(l) + Ca+2(aq)
Um fenômeno físico que também pode ser observado no início do experimento é a flutuação do ovo com casca, associada à formação de uma camada de bolhas na superfície. Ocorre que a densidade deste conjunto (ovo/camada de bolhas) é menor que a densidade da solução de vinagre. A este fenômeno dá-se o nome de empuxo.
A solução concentrada de açúcar foi aquecida para facilitar na dissolução do açúcar e aumentar sua concentração com a evaporação de parte de água.
Após o aquecimento a solução apresentava-se com uma coloração amarelada (figura 21).
Figura 21. Solução concentrada de açúcar cirstal.
O ovo inserido na solução de açúcar concentrado ficava boiando devido a
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sua densidade ser menor do que a da solução concentrada de açúcar (figura 22.
A). Para que houvesse um maior efeito osmótico da solução sobre o ovo, este foi afundado com auxílio de uma colher, de tal forma que ficasse imerso na solução.
Figura 22. A. Ovo de cordona sem casca inserido na solução concentrada de açúcar (flutuando). B. Ovo de codorna sem casca inserido na solução concentrada de açúcar (imerso com a ajuda de uma colher).
Para que fosse possível observar a ação da solução concentrada de açúcar sobre o ovo de codorna sem casca, foi necessário utilizar uma colher de sopa para mantê-lo totalmente imerso.
Após 72 horas verificou-se que o ovo submetido à osmose pela ação da solução concentrada de açúcar apresentava volume menor que o ovo de codorna com casca, o resultado mostra que houve passagem da água interna do ovo para a solução concentrada de açúcar o que provocou a redução do seu volume (figura 23).