MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi realizado na área experimental do Setor de Forragicultura na Universidade Federal de Goiás – Regional Jataí, GO, localizada a 17º53' de Latitude Sul, 51º43' de Longitude Oeste a 670 metros de altitude.

Segundo a classificação Köppen (KÖPPEN & GEIGER, 1928) o clima da região é do tipo Cw, mesotérmico, com duas estações definidas como seca (abril a setembro) e chuvosa (outubro a março).

O período experimental abrangeu os meses de janeiro a maio de 2014 e no início do período ocorreu uma estiagem atípica resultando em volume de chuva 45,40 e 33,42% menor em relação à média dos anos de 2012/2013, respectivamente em janeiro e fevereiro, resultando em 140,85 e 88,65 mm, a menos no volume de chuva daqueles meses (Figura 1b).

Figura 1b – Precipitação total diária (mm), temperatura máxima, mínima e média diária compensada (°C) no período de janeiro a maio do ano de 2014 (INMET/JATAÍ, 2014)

O solo da área experimental é classificado como Latossolo Vermelho distroférrico (EMBRAPA, 2009) e as correções e adubação foram realizadas de acordo com as recomendações de Camargo & Novo (2009) a partir das características químicas e físicas observadas no solo antes da implantação do experimento (Tabela 1b).

Tabela 1b - Análise química e física do solo da área experimental

pH (cmolc/dm³) (mg/dm³) g/kg (cmolc/dm³)

V(%)

(H2O) H+Al Al Ca Mg Ca+Mg K K P MO SB CTC

4,80 6,35 0,15 1,02 0,65 1,67 0,286 111,5 2,74 24,79 1,96 8,31 23,57

No início do período experimental foi realizado o corte de uniformização na pastagem de Brachiaria brizantha cv. Marandu a 15 cm de altura em todas as unidades experimentais para proceder à aplicação dos tratamentos que consistiram de três doses de nitrogênio (0, 50, e 200 kg/ha) utilizando a ureia como fonte e duas doses de Azospirillum brasilense Masterfix Gramíneas®

produzido com as estirpes Abv5 e Abv6 (0 e 200 mL/ha) com concentração bacteriana de 2,0 x 108 UFC (unidade formadora de colônia) por mL.

A aplicação de Azospirillum brasilense foi realizada com uma bomba de pressão manual acoplada em garrafa “pet” de dois litros usando a diluição do concentrado de Azospirillum brasilense Masterfix Gramíneas® de acordo com as recomendações do fabricante (200 mL/ha), enquanto que o nitrogênio foi distribuído a lanço nas unidades experimentais.

O delineamento estatístico utilizado foi em blocos casualizados com quatro repetições, em arranjo fatorial 3 X 2 (três doses de N e duas doses de Azospirillum brasilense totalizando 24 parcelas de 16 m² e 1 m² de espaçamento entre cada unidade experimental.

O final de cada ciclo foi determinado utilizando como parâmetro a interceptação luminosa de 95% monitorada semanalmente em três pontos distintos das unidades experimentais nas horas de maior incidência de luz (das 11h30min às 13h30min) com o auxílio de um ceptômetro (AccuPAR® modelo LP-80). Em função disso, os ciclos avaliativos dos tratamentos com a adubação de 0, 50 e 200 kg de N/ha com e sem a inoculação foram de 128, 98 e 34 dias, respectivamente.

Houve a necessidade de realizar um segundo corte no tratamento de 200 kg de N/ha aos 46 dias após o primeiro. Desta forma, no intervalo de 80 dias as parcelas que receberam 200 kg de N/ha produziram dois ciclos enquanto as demais produziram um único ciclo.

Após a aplicação dos tratamentos foram marcados quatro perfilhos por parcela com fitilhos de cores diferentes para a realização da morfogênese anotando o tamanho e o número de folhas do perfilho marcado. Cada perfilho teve sua localização demarcada com uma estaca de bambu identificada com um fitilho da mesma cor do perfilho localizado por ela.

Para a quantificação da massa seca de raiz foram realizadas duas coletas por profundidade de solo por parcela utilizando cilindros de aço com 3 polegadas de diâmetro e 60 cm de altura, introduzidos no solo com a ajuda de uma marreta nas profundidades de 0 a10 cm e de 10 a 20 cm a 5 cm de distância das touceiras cortadas para a avaliação da produtividade. Após a coleta o material foi acondicionado em saco plástico identificado para posterior lavagem em laboratório a fim de separar as raízes da terra, com o auxílio de peneiras. As raízes separadas foram acondicionadas em sacos de papel, pesadas e levadas a estufa de ventilação forçada a 65ºC, para a determinação da produção de massa seca de raiz em kg/ha.

Para quantificar a atividade da enzima redutase do nitrato, após 76 dias do início do experimento foi utilizada a metodologia adaptada de Meguro &

Magalhães (1982). Foram coletadas 10 folhas por unidade experimental às 10h00min da manhã garantindo intensidade de luz e calor adequado para que a atividade enzimática fosse máxima. Rapidamente, as amostras foram levadas

para o laboratório onde foram lavadas com água destilada e subdivididas gerando quadruplicatas por parcela. As folhas foram cortadas em fragmentos de aproximadamente 0,2 mm de espessura, sendo utilizados 0,2 mg de matéria fresca para a análise. Posteriormente, as amostras foram colocadas em meio de incubação composto por 5 mL de solução tampão fosfato (K2HPO4 + KH2PO4 0,1 mol/L, pH 7,5) adicionado de 1 mL de nitrato de potássio (KNO3 a 0,25 mol/L) e 1 mL de N-propanol (1% v/v). Após agitação em “vortex” os frascos foram envolvidos em papel alumínio e inseridos em estufas BOD (Demanda Bioquímica de Oxigênio) por 1 hora a 30°C. Após a filtração uma alíquota de 1 mL de solução foi transferida para tubos de ensaio com 1,0 mL de sulfanilamida diluída a 0,1% em HCl (3,0 mol/L) para agitação em “vortex”. Após 30 minutos foram adicionados 1,0 mL de N-naftiletileno diamina a 0,01% seguido de nova agitação em “vortex”. Após 15 minutos procedeu-se a leitura em espectrômetro a 540 nm em absorbância. As absorbâncias obtidas foram comparadas com uma curva padrão de nitrito, gerada a partir de quantidades conhecidas, sendo expressa a atividade da enzima redutase do nitrato em µmol de nitrito/hora/grama de matéria fresca (μmol de NO2-

/h/g MF).

Para a quantificação do teor de clorofila total foi utilizado o aparelho clorofiLOG CFL 1030 da Falker, fazendo-se a leitura em 10 folhas totalmente expandidas por parcela escolhendo-se a folha abaixo da folha bandeira (última folha completamente expandida) no final do ciclo avaliativo (95% de interceptação luminosa) sendo o valor dado pelo índice Soil Plant Analysis Development (SPAD).

Para determinar a produção de massa, a coleta das amostras foi realizada rente ao solo utilizando um gabarito 0,25 m² lançado ao acaso duas vezes por parcela. O material foi acondicionado em sacos identificados e levados ao laboratório para a separação manual das amostras em folha, colmo e material morto para o estrato pastejável (P: até 15 cm do solo) e estrato não pastejável (NP: do solo até 15 cm). Para a realização dos cortes foram utilizadas tesouras tipo “poda de jardineiro”. Cada componente foi pesado e seco em estufa de ventilação forçada a 65ºC, até atingir peso constante (aproximadamente 72

horas) para a determinação da matéria pré-seca, sendo assim possível determinar a produção de folhas, colmo e material morto.

Após a pesagem foi realizada a homogeneização do material que foi então moído em moinho de facas tipo “Willey” com peneira de 1 mm para a determinação da matéria seca (MS) e da proteína bruta (PB) conforme metodologias descritas por Silva & Queiroz (2002) em duplicata no Laboratório de Nutrição Animal na Regional Jatai da Universidade Federal de Goiás.

Procedeu-se a análise de variância dos dados SAS versão 9.3 (SAS, 2011) a 5% de probabilidade considerando o delineamento em blocos casualizados (DBC) e o desenho fatorial 2x3 para a distribuição dos tratamentos.

As variáveis foram analisadas em parcelas subdivididas, analisando o efeito do bloco e da dose na parcela e da aplicação de Azospirillum brasilense e a interação na sub parcela. Para as variáveis clorofila e PB foi aplicada a transformação box-cox. Posteriormente, foi avaliado o efeito de corte (primeiro e segundo) do tratamento de 200 kg/ha de nitrogênio, aplicando a transformação log(x) para a produção de folhas do estrato pastejável e do estrato não pastejável e a transformação box-cox para a produção de colmo e o somatório do estrato não pastejável.