Para avaliar se a diminuição do crescimento observada após a incubação das bactérias com as nanopartículas foi devido à diminuição da viabilidade celular provocada pela ação bactericida da nanopartícula com Ag, as culturas foram posteriormente plaqueadas em meio sólido e o seu crescimento foi avaliado.
A Figura 18 mostra o crescimento de células P. aeruginosa durante 24 horas de crescimento em meio sólido com as diferentes amostras. A amostra controle (CSH puro) e CSH-Ag3 apresentaramum crescimento significativo de bactérias, não sendo possível observar a ocorrência de uma expressiva morte celular. Porém como podem ser observadas, as bactérias em contato com a amostra com a maior concentração de prata (CSH-Ag10) exibiram quase ou nenhum crescimento bacteriano ao longo do período de 24 horas.
Figura 18: Teste de crescimento em placa de ágar. O crescimento da bactéria Pseudomonas aeruginosa não foi inibido pelas amostras de CSH puro e de CSH -Ag3. O CSH-Ag10 inibiu totalmente o crescimento bacteriano.
Visualmente não podemos observar uma diminuição do crescimento bacteriano na amostra de CSH-Ag3 em relação ao inóculo incubado com o CSH puro. Uma possível causa é alta concentração do inóculo plaqueado para essas amostras, não sendo possível a distinção visual da quantidade de colônias. Dessa forma, este experimento deverá ser repetido com diluições seriadas das amostras, de forma que seja plaqueada uma quantidade de inóculo passível de contagem em placa. Esse teste confirmou a expressiva diminuição do crescimento celular da amostra tratada com CSH-Ag10, o que sugere uma ação bactericida das nanopartículas.
Como esperado, a amostra com maior concentração de prata apresentou o melhor desempenho para prevenir o crescimento de bactérias. Esse teste foi importante para determinar se a prata estava induzindo o crescimento das bactérias.
6 DISCUSSÃO
Associado à sua grande área superficial e alta reatividade, partículas metálicas na escala nanométrica apresentam notáveis propriedades físicas, químicas e biológicas (Lok, Ho et al.
2007). Nanopartículas com tamanho entre 1e 100 nm em pelo menos uma dimensão tem aplicações versáteis em muitos produtos, têm sido amplamente utilizadas em instrumentos cirúrgicos, próteses, válvulas cardíacas, tecidos, produtos de higiene pessoal e recipientes para alimentos (Lee, Kim et al. 2012). Dentre os nanomateriais mais importantes, as nanopartículas de prata destacam-se devido ao seu amplo espectro de atividade antimicrobiana (Song, Li et al. 2012), por isso mais de um terço dos produtos de consumo que contém nanomateriais são baseados em nanopartículas de prata, devido principalmente a essa propriedade e seu extenso espectro de ação (Dantas 2011).
As nanopartículas podem ser obtidas por diversos métodos de síntese, tais como físicos, químicos, eletroquímicos, e também por métodos que sem a presença de substâncias tóxicas ambientalmente, como o da química verde (Dubey and Bhadauria 2009). Dependendo do método utilizado podem ser obtidas nanopartículas com diferentes morfologias, tamanhos, formas e composição química (Rauwel and Rauwel 2015).
As nanopartículas de prata são produzidas com sucesso por vários métodos e seu efeito tóxico permanece sob estudo, porém a síntese por redução química é o método mais utilizado para produção dessas nanopartículas com diferentes formas e tamanhos. Lee and Meisel, utilizaram esse método com a redução pelo borohidreto de sódio (NaBH4) (Lee and Meisel 1982), e Turkevitch utilizou a redução pelo citrato de sódio (C6H5O7Na3) (Turkevich, Stevenson et al. 1951).Outro método comum para a síntese de nanopartículas de prata é o utilizado por Creighton, em que AgNO3 é reduzido utilizando-se borohidreto de sódio (NaBH4) como agente redutor, que permite a obtenção de partículas de (~10 nm) com estreita distribuição de tamanho (Evanoff and Chumanov 2005). O método de Turkevich é um dos mais utilizados para sintetizar nanopartículas de ouro e outras partículas metálicas, envolve a redução do ácido clórico com citrato de sódio, produzindo partículas de aproximadamente 10 nm (Evanoff and Chumanov 2005).
O presente estudo investigou a produção de silicato de cálcio incorporado com diferentes concentrações de prata via precipitação química, precipitando o sólido a partir de sais dissolvidos que servem tanto como fonte de cálcio e silício, como observado por (Wan, Chang et al. 2005). Este método permite controlar a composição do CSH (Razão Ca/Si), controlando o teor de íons cálcio em solução (Zeena and Prashant 2004), além disso este
método apresenta grandes vantagens, como o baixo custo de produção, rentabilidade e rapidez de síntese. Porém há diversos métodos relatados na literatura para a síntese de nanopartículas que foram empregados em trabalhos anteriores como: o método de sol-gel (Sundarabharathi, Parangusan et al. 2017), decomposição térmica (melhor método desenvolvido até o momento para o controle de tamanho e morfologia das nanopartículas), microemulsão (He, Huang et al.
2017), síntese hidrotérmica (Liu and Yu 2012), métodos eletroquímicos (Rauwel and Rauwel 2015), deposição química a vapor (Duan, Rani et al. 2018), sintetize por via aquosa (Turkevich and Kim 1970, Furlong, Launikonis et al. 1984, Kamat 2002, Crespilho, Zucolloto et al. 2006), ou a síntese verde. Esta última promove a redução do metal utilizando agentes redutores de baixa ou nula toxicidade, como substituinte a reagentes químicos, tornando-se uma alternativa sustentável (Albernaz 2014).
As nanopartículas apresentam alta tendência de aglomeração por possuírem grande razão área-volume(Atkins 1994), essa aglomeração é causada pela energia de Van der Walls e para evitar a agregação das partículas, forças repulsivas devem sobrepor às atrativas(Jiang, Oberdorster et al. 2009). Alguns dos polímeros usados para estabilização de nanopartículas de prata são: polivinilpirrolidona (PVP) (Wiley, Sun et al. 2005, El-Badawy, Luxton et al. 2010), polivinil álcool (PVA) (Pencheva, Bryaskova et al. 2012), polietilenoglicol (PEG) (Popa, Pradell et al. 2007), poliacrilamida (Chen, Wang et al. 2006), carboximetilcelulose (Garcia 2011).
Nesse trabalho o poli etileno glicol (PEG) foi utilizado, e outros trabalhos mostram que ele pode ser usado com sucesso como um agente redutor para preparar nanopartículas de metal (Luo and Shi 2004). Espera-se que o PEG utilizado na síntese de CSH possa promover a redução dos íons de prata incorporados ao meio. A utilização de PEG é interessante, pois apresenta toxicidade relativamente baixa (Li, Xie et al. 2013). Do nosso conhecimento este é o primeiro trabalho de produção de nanopartículas de prata metálica incorporada com o silicato de cálcio usando o nitrato de prata via precipitação química.
Neste trabalho foi seguida a metodologia sugerida por Pelisser et al. (Pelisser 2012) para determinar a quantidade de óxido de cálcio (CaO) e de sílica (SiO2) presente na estrutura do CSH,a fim de estimar a relação C/S do CSH produzido.A análise por fluorescência de raios X confirmou a incorporação de prata no silicato de cálcio e a determinação dos teores dos principais elementos das amostras. Como foi observado por Magyari et al. (Magyari, Stefan et al. 2014), os padrões de difração de raios X das amostras de borofosfato incorporados com prata revelaram o caráter amorfo de todas as amostras preparadas, assim como as amostras de CSH produzidas nesse trabalho.
O aumento da concentração da prata não segue a proporção das incorporações realizadas, podendo indicar que há possivelmente um limite na incorporação da prata. Possivelmente uma porcentagem de prata pode estar se perdendo após lavagem e filtração do material durante a síntese química. A incorporação de outros íons como o sódio (Na+) e potássio (K+) em silicatos foram observados por Ragoen et al; que também indicaram uma concentração limite de incorporação (Ragoen, Marple et al. 2017).
A análise por espectroscopia de fotoelétrons de raios X (XPS) de alta resolução do oxigênio mostrou que o CHS se encontra na estrutura do material em quatro tipos de ambientes químicos distintos, como foi descrito por (Black, Garbev et al. 2004). A prata pode estar acima de um teor limite de razão BO/NBO, poderá estar ocupando sítios além da superfície como descrito por (Black, Garbev et al. 2006). Como foi observado no nosso trabalho e por Lucacel et al., as amostras incorporadas mostraram a presença de Ag metálico na superfície, o espectro de alta resolução da prata foi desconvoluído em dois dupletos (Ciceo Lucacel, Radu et al. 2014).
Diversos trabalhos buscaram compreender a estrutura do CSH para uma descrição consistente. O silicato de cálcio além de apresentar variações de composição muito importantes, possui um difratograma de raios-X não muito comum, característica de um modo de organização intermediário entre o de um cristal tridimensional e um sólido amorfo (Minet 2003). Muitos modelos tentaram descrever a sua estrutura na literatura como (Taylor 1950, Powers 1964, Feldman and Sereda 1968, Ramachandran, Feldman et al. 1981, Fujii and Kondo 1983, Taylor 1986, Richardson and Groves 1992, Cong and Kirkpatrick 1996). A evolução desses modelos reflete o desafio de compreender uma composição variável, ordenada e com muitos defeitos estruturais. Os átomos de cálcio possuem o tipo de conformação estrutural comum a tobermorita e jennite (Hamid 1981, Viehland 1997). A estrutura do mineral clinotobermorita é a que mais se aproxima do silicato de cálcio puro (CSH), de acordo com os dados da literatura (Merlino, Bonaccorsi et al. 2000).
Estudos morfológicos com a microscopia eletrônica de varredura no modo transmissão (TSEM) mostraram as partículas de prata nanométricas incorporadas na estrutura do silicato de cálcio. Estudos demonstram que cerâmicas, metais, polímeros e compósitos com tamanho de grão manométrico melhoram seletivamente a função dos osteoblastos e assim proporcionam um maior crescimento ósseo comparado a materiais com grãos de tamanho micrométrico (El-Kady, Ali et al. 2012). A prata na forma de nanopartículas tem uma superfície de contato infinitamente maior e suas propriedades são enormemente aumentadas (Garcia 2011). Nahrawy et al. produziu um nanocomposto de silicato de quitosano / cálcio e
incorporou com nanopartículas de prata (1% molar), e pode observar nanopartículas esféricas uniformes, com dimensões inferiores a 100 nm (El-Nahrawy, Ali et al. 2016). E Lucacel et al.
produziu borosilicato incorporado com prata e as micrografias das amostras mostraram as superfícies heterogêneas e a morfologia do material mudou significativamente com a adição de prata, o que não aconteceu com o material desse estudo (Ciceo Lucacel, Radu et al. 2014).
Os materiais bioativos são materiais que têm a capacidade de formar uma ligação interfacial forte com o tecido vivo adjacente, que ocorre pela precipitação de policristais de hidroxiapatita (HAp) em locais bastante específicos das fibrilas de colágeno, vinculando a superfície inorgânica do implante ao tecido (Hench and Wilson 1993). O tempo para que esta ligação ocorra e o mecanismo da ligação irá variar para cada tipo de material (Hench 1991).
Entre esses compostos bioativos, os silicatos são materiais muito estudados para formar uma camada de hidroxiapatita óssea (HAp) que é fundamental para uma forte ligação interfacial entre o dispositivo e o osso (Hench 1991, Hench 2006). Assim como pode ser observada por microscopia eletrônica, a nucleação de apatita ocorreu em todas as amostras testadas neste estudo. Da literatura sabe-se que o ensaio de bioatividade envolve os seguintes fenômenos: A formação de camada de apatita ocorre com a dissolução de sulfato de cálcio causou um aumento no local de supersaturação de íons Ca2 +, causando o aumento da produção iônica de apatita no fluido circundante, que acelera a taxa de nucleação da apatita (Tan, Liu et al. 2015). Liu et al. também observaram que o silicato de cálcio incorporado com magnésio promove a deposição de uma camada de apatita depois de 5 dias de imersão na solução SBF, indicando que esse material possui excelente bioatividade e pode ligar-se a estrutura óssea nativa quando implantado in vivo (Liu, Chu et al. 2004).
O uso indevido de antibióticos promove a seleção de estirpes de bactérias resistentes (Kyriacou, Brownlow et al. 2004) o que representa um problema sério de saúde pública e, portanto, há forte incentivo para desenvolver novos agentes bactericidas (Sondi and Salopek- Sondi 2004). De acordo com (Morones, Elechiguerra et al. 2005), as atuais pesquisas com nanomateriais antimicrobianos torna emergencial o desenvolvimento de novas alternativas de terapias contra bactérias multi-resistentes.
O principal interesse na utilização de agentes antimicrobianos com prata é associado ao aumento no número de bactérias resistentes aos antibióticos. As bactérias apresentam baixa propensão de desenvolverem resistência contra a prata, considerando o seu amplo modo de ação (Volker, Thorsten et al. 2004). A atividade antimicrobiana da prata é bem conhecida deste os tempos antigos (Shrivastava, Bera et al. 2007) e tem sido demonstrado que em baixas concentrações (Pal, Tak et al. 2007). De acordo com (Zhao and Stevens 1998), quando
comparada com outros metais, a prata exibe alta toxicidade para micro-organismos e baixa toxicidade para células animais. Além disso, é bem conhecido que a prata possui amplo espectro de atividade antimicrobiana sobre bactérias, fungos e vírus (Balazs, Triandafillu et al.
2014).
De acordo com (Damm, Munstedt et al. 2007), a prata atua de forma complexa sobre os micro-organismos possuindo diversos mecanismos de ação. Há relatos de que a liberação de íons Ag+ a partir das nanopartículas metálicas é responsável por sua atividade antimicrobiana.
Porém, não está claro se o mecanismo de ação antimicrobiana das nanopartículas de prata está relacionado apenas coma liberação de íons ou se as próprias nanopartículas apresentam uma toxicidade específica (Navarro, Piccapietra et al. 2008). A ação bactericida da prata inibe a cadeia respiratória celular (Bragg P and Rainnie 1973) e o transporte de fosfatos (Schreurs and Rosenberg 1982). O nível mínimo de íons de prata necessário em qualquer situação para eliminar infecções ainda não é conhecido, mas estudos são urgentemente necessários (Lansdown 2006).
É bem documentado na literatura que a atividade antimicrobiana das nanopartículas de prata é influenciada pelo tamanho e forma das partículas, sendo as menores (~ 5 nm) e com estrutura triangular as mais eficientes (Chen, Liu et al. 2006). Também há relatos de que as cargas das nanopartículas de prata influenciam sua atividade antimicrobiana, sendo as positivamente carregadas as mais eficientes (Durán, Marcato et al. 2010).
O efeito bactericida é diretamente proporcional à concentração de íons Ag+, então quanto maior a concentração de prata maior será o seu efeito antimicrobiano, e a toxicidade de prata é dependente da dose aplicada (Chung, Hsieh et al. 2006). A influência das nanopartículas de prata no combate aos microrganismos não é totalmente identificada na literatura (El- Nahrawya, Alib et al. 2016). Como foi constatado por Sprado et al; o DNA da bactéria perde sua capacidade de replicação e as proteínas celulares se desativam devido ao efeito da presença de nanopartículas de prata (Spadaro, Berger et al. 1974). Além disso, Sandi et al.
descreveu que o Ag se liga com os grupos funcionais das proteínas que posteriormente na desnaturação de proteínas (Sondi, Goia et al. 2003). Segundo Dallas et al. e Youssef et al;
devido à interação entre Ag e as diferentes partes de partes da membrana externa, causa variações estruturais e degradação e morte celular (Dallas, Sharma et al. 2011, Youssef, Abdel-Aziz et al. 2014).
Os resultados dos ensaios microbiológicos apresentados demonstraram que o silicato de cálcio incorporado com nanopartículas de prata são promissoras como agentes antimicrobianos, como pode ser observado nas análises de microscopia eletrônica das
bactérias de P. aeruginosa em contato com o CSH-puro (controle) e CSH-Ag3%. Nestas amostras as bactérias estão distribuídas de forma homogênea, não apresentando extravasamento de material celular como foi observado nas células tratadas com CSH- Ag10%. Os resultados são semelhantes aos obtidos por (Feng, Wu et al. 2000), que avaliaram o efeito antimicrobiano de AgNO3 sobre E. coli e S. aureus. Entretanto, estas modificações celulares não foram observadas por (Morones, Elechiguerra et al. 2005), utilizando nanopartículas de prata possivelmente devido à diferente concentração de prata utilizada.
Assim como neste trabalho, a técnica de crescimento bacteriano em Agar utilizada por (Scorzoni, Benaducci et al. 2007) para análise da atividade antimicrobiana de M. citrifolia não foi suficientemente esclarecedora sobre o efeito do agente antimicrobiano sobre a bactéria, sugerindo a realização do método de diluição seriada para obter o exato número de colônias e avaliar com melhor precisão o efeito do agente antimicrobiano sobre a multiplicação e crescimentos dos micro-organismos.
Um dos mecanismos de ação bactericida dos íons de prata é devido à sua ação catalítica, destruindo a membrana plasmática das bactérias, pela diferença de potencial (eletropotência) entre a parte interna e externa das células (Monteiro, Gorup et al. 2011). Outra ação ocorre quando o íon de prata penetra na membrana plasmática da célula bacteriana, destruindo o citoplasma da célula, isso provavelmente é o que está afetando o crescimento bacteriano (Panacek, Kolar et al. 2009, Vazquez-Muñoz, Avalos-Borja et al. 2014).
As nanopartículas de prata têm grande afinidade com grupos que possuem os elementos enxofre e fósforo, que são encontrados tanto nas membranas como no interior das bactérias.
Sua interação ocorre com a membrana celular causando danos no processo de respiração celular e, no interior das mesmas, interagem com o DNA impedindo a divisão celular (Morones, Elechiguerra et al. 2005).
O mecanismo dos efeitos inibidores do crescimento de microrganismos pelas nanopartículas de prata ainda não foi bem compreendido. Uma possibilidade é a de que a inibição do crescimento pode ser relacionada com a formação de radicais livres a partir da catálise superfície das nanopartículas de prata (Kim, Kuk et al. 2007). Segundo (Fouda, Hassan et al. 2013), uma geração descontrolada de radicais livres pode atacar os lipídios da membrana e levar a sua ruptura da membrana e assim oxidando a estrutura molecular de bactérias (Kim, Lee et al. 2011).
7 CONLUSÃO
Nesse trabalho foi realizada a síntese e a caracterização de silicatos de cálcio hidratado incorporado com prata para ser aplicado como um biomaterial na área de engenharia óssea.
Desta maneira, investigamos a estrutura atômica, morfologia, composição química, bioatividade, e atividade antibacteriana. Através das análises de fluorescência de raios X foi possível verificar que a prata foi incorporada com sucesso. Pela análise do XPS, foi observada a presença de prata metálica e oxigênio presente nas amostras em quatro tipos de ambientes químicos diferentes. Os espectros de alta resolução mostraram que as amostras são bastante semelhantes, com exceção da amostra CSH-Ag10, no entanto um estudo mais aprofundado será necessário para confirmar essa exceção. A difração de raios X mostrou que a estrutura do silicato de cálcio é semi-cristalina multifásica, semelhante ao mineral clinotobermorita (Ca5Si6O14(OH)45(H2O)). Também foi verificada a presença da prata em forma metálica concordando com o resultado do XPS. As micrografias do silicato de cálcio incorporadas com prata mostraram partículas de prata em torno de 5 a 30 nm, observando-se um aumento da quantidade de nanopartículas entre as estruturas fibrilares do material à medida que foi aumentada a concentração da prata. O material apresentou comportamento bioativo, na medida em que foi verificada sobre a superfície de todas as amostras, a presença de uma espessa camada de apatita, indicando que provavelmente esse material possui excelente capacidade de biomineralização. Foi verificado também que a incorporação da prata não provocou alteração significativa na bioatividade do material. O estudo mostrou que as nanopartículas de prata têm efeito inibitório considerável sobre o crescimento das bactérias Pseudomonas aeruginosa, principalmente em concentrações mais elevadas.Como perspectiva futura e para avaliar a viabilidade real do material produzido neste trabalho para uso em biomateriais para aplicações em engenharia óssea serão realizados testes de citotoxicidade com osteoblastos humanos.
8 PERSPECTIVAS FUTURAS
Análises de DRX serão feitas para confirmar a presença de um fosfato de cálcio mineralizado, nomeadamente apatita, na medida em que só temos evidências morfológicas e químicas.
Estudos serão feitos sobre a resistência mecânica do material, visto que isso é um dos grandes problemas de dispositivos de substituição a base de fosfato de cálcio.
Serão investigados o comportamento mecânico e dissolução desses materiais.
Medir o tamanho (diâmetro hidrodinâmico médio) das nanopartículas de prata incorporadas nas amostras por espalhamento dinâmico de luz (DLS).
Realizar a caracterização estrutural das nanopartículas de prata por espectroscopia de UV- Vis.
Quantificar a camada de apatita que se formou nas amostras após a imersão em solução SBF através de imagens de MEV da secção transversal das pastilhas.
Os testes bacterianos serão repetidos com uma bactéria gram-positiva para avaliação do efeito antibacteriano em bactérias dessa estrutura.
Fazer diluições seriadas e a contagem do número de UFC/mL das bactérias para determinação do número de microrganismos viáveis após o efeito da prata.
Avaliar a citotoxicidade desse material, com células de mamífero, nomeadamente cultura celular de osteoblastos.
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