Testes de Citotoxicidade

Os resultados obtidos com as análises de Citotoxidade foram apresentados em um gráfico, no qual o percentual de viabilidade celular foi plotado em função da concentração das NPs dissolvidas, para os três tempos de incubação, 24, 48 e 72 horas. Também foram testados os efeitos citotóxicos para o controle da dispersão utilizada neste trabalho. Esses estudos foram conduzidos sob a supervisão do Prof. Dr. Marcos Moreli, do Curso de Biomedicina da UFJ, e auxílio da aluna de mestrado Marielena Vogel Saivish.

A figura 52 apresenta os resultados de análises de viabilidade celular em função da concentração de NPs das ferritas Zn250 e Zn800 em solução, obtidas após 24 h, 48 h e 72 h de incubação. Como apresentado na figura 52(A), o valor médio percentual da viabilidade celular após 24 h de incubação, foi igual 34%, para NPs com concentrações variando entre 125 a 1000 µg/mL. Para a solução de NPs preparada na concentração de 62,5 µg/mL, o valor médio percentual da viabilidade celular foi igual a 61%, conforme apresentado na figura 52(A). Após 48 horas de incubação, o percentual de viabilidade celular, variou entre 50% a 63%, para as amostras com concentrações entre 1000 µg/mL e 62,5 µg/mL, conforme apresentado na figura 52(B). Para o período de 72 horas de

Figura 52: Taxa de viabilidade celular pelas concentrações testadas das ferritas de zinco calcinadas à 250 e 800 °C dispersas por nanoemulsão em comparação com o Controle (máxima viabilidade celular) após incubação de 24, 48 e 72 horas à 37 °C. *(p<0,05). (A) (B) e (C) representam a viabilidade celular para a NP calcinada à 250 °C, nos períodos de 24, 48 e 72 horas, respectivamente. (D) (E) e (F) correspondem à viabilidade da NP calcinada à 800 °C há 24, 48 e 72 horas, respectivamente.

97 incubação, o valor percentual da viabilidade celular variou entre 53% a 64%, para as amostras preparadas em concentrações entre 1000 µg/mL e 62,5 µg/mL, conforme apresentado na figura 52(C). Os resultados sugerem que o valor percentual de viabilidade celular ficou estável após 48h e 72h de incubação. Além disso, todas as concentrações se mostraram diferentes significativamente do controle (*p<0,05).

As figuras 52(D-E) apresentam os valores percentuais de viabilidade celular para as amostras Zn800 preparadas nas concentrações iguais à 1000 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL, 125 µg/mL e 62,5 µg/mL. Para amostras de ferrita Zn800, preparadas em concentrações, que variaram entre 1000 µg/mL à 62,5µg/mL, os valores percentuais de viabilidade celular obtidos após 24h, 48h e 72h de incubação, variaram entre (29% a 65%), (48% a 62%) e (45% a 63%). As figuras 52(E) e (F) sugerem que houve um leve aumento no valor percentual de viabilidade celular para as amostras preparadas com concentrações entre 500 µg/mL e 125 µg/mL. Para a amostra preparada na concentração igual a 62,5 µg/mL, não houve aumento no percentual de viabilidade celular após 48h e 72h de incubação, conforme apresentado nas figuras 52(E, F). A temperatura de calcinação não modificou o valor médio percentual da viabilidade celular, conforme representado na figura 52. Assim, todas as concentrações mostraram diferenças significativas do controle (*p<0,05).

Figura 53: Taxa de viabilidade celular pelas concentrações testadas das ferritas de cobalto calcinadas à 250 e 800 °C dispersas por nanoemulsão em comparação com o Controle (máxima viabilidade celular) após incubação de 24, 48 e 72 horas à 37 °C. *(p<0,05). (A) (B) e (C) representam a viabilidade celular para a NP calcinada à 250 °C, nos períodos de 24, 48 e 72 horas, respectivamente. (D) (E) e (F) correspondem à viabilidade da NP calcinada à 800 °C há 24, 48 e 72 horas, respectivamente.

98 A figura 53 apresenta os resultados de análises de viabilidade celular em função da concentração de NPs das ferritas Co250 e Co800 em solução, obtidas após 24 h, 48 h e 72 h de incubação. Como apresentado na figura 46(A), o valor médio percentual da viabilidade celular após 24 h de incubação, foi abaixo de 40%, para NPs com concentrações variando entre 125 a 1000 µg/mL. Para a solução de NPs preparada na concentração de 62,5 µg/mL, o valor médio percentual da viabilidade celular foi igual a 41%, conforme apresentado na figura 53(A). Após 48 horas de incubação, o percentual de viabilidade celular, variou entre 40% a 42%, para as amostras com concentrações entre 1000 µg/mL e 125 µg/mL, conforme apresentado na figura 53(B). Para a solução de NPs preparada na concentração de 62,5 µg/mL, o valor médio percentual da viabilidade celular aumentou levemente para 50%, conforme apresentado na figura 53(B). Para o período de 72 horas de incubação, o valor percentual da viabilidade celular variou entre 52% a 61%, para as amostras preparadas em concentrações entre 1000 µg/mL e 125 µg/mL, conforme apresentado na figura 53(C). A figura 53(C) também mostra que o valor percentual da viabilidade celular para a concentração de NPs iguais a 62,5 µg/mL foi igual a 59%.

Diferentemente das amostras Zn250 e Zn800, os resultados sugerem que o valor percentual de viabilidade celular aumentou levemente após 48h e 72h de incubação, conforme apresentado nas figuras 53(B-C). Além disso, todas as concentrações se mostraram diferentes significativamente do controle (*p<0,05).

As figuras 53(D e E) apresentam os valores percentuais de viabilidade celular para as amostras Co800 preparadas nas concentrações iguais à 1000 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL, 125 µg/mL e 62,5 µg/mL. Para amostras de ferrita Co800, preparadas em concentrações, que variaram entre 1000 µg/mL à 62,5µg/mL, os valores percentuais de viabilidade celular obtidos após 24h, 48h e 72h de incubação, variaram entre (42% à 54%), (45% à 53%) e (48% à 54%). As figuras 53(D e E) sugerem que durante 24h e 48 h após a incubação, o percentual de viabilidade celular manteve-se estável, havendo um leve aumento após 72h de incubação, conforme representado na figura 53(C). O aumento da temperatura de calcinação de 250 °C para 800 °C, aumentou levemente o valor percentual da viabilidade celular para as amostras incubadas por 24h, conforme representado pelas figuras 53(A e D). Não foram observadas mudanças bruscas no valor médio percentual da viabilidade celular para as amostras calcinadas à 250 °C e 800 °C, incubadas a 48h e 72h, conforme representado nas figuras 53(B, C, E, F). Desse modo, todas as concentrações mostraram diferenças significativas do controle (*p<0,05).

99 A figura 54 apresenta os resultados de análises de viabilidade celular em função da concentração de NPs das ferritas mistas ZnCo250 e ZnCo800 em solução, obtidas após 24 h, 48 h e 72 h de incubação. Como apresentado na figura 54(A), o valor médio percentual da viabilidade celular após 24 h de incubação, foi abaixo de 40%, para NPs com concentrações variando entre 125 a 1000 µg/mL. Para a solução de NPs preparada na concentração de 62,5 µg/mL, o valor médio percentual da viabilidade celular foi igual a 63%, conforme apresentado na figura 54(A). Após 48 horas de incubação, o percentual de viabilidade celular, permaneceu estável em torno de 40%, para as amostras com concentrações entre 1000 µg/mL e 125 µg/mL, conforme apresentado na figura 54(B).

Para a solução de NPs preparada na concentração de 62,5 µg/mL, o valor médio percentual da viabilidade celular aumentou levemente para 59%, conforme apresentado na figura 54(B). Para o período de 72 horas de incubação, o valor percentual da viabilidade celular foi aproximadamente igual a 50% para as amostras preparadas em concentrações entre 1000 µg/mL e 125 µg/mL, conforme apresentado na figura 54(C). A figura 54(C) também mostra que o valor percentual da viabilidade celular para a concentração de NPs iguais a 62,5 µg/mL foi igual a 60%. Similarmente às amostras Zn250 e Zn800, os resultados sugerem que o valor percentual de viabilidade celular

Figura 54: Taxa de viabilidade celular pelas concentrações testadas das ferritas mista calcinadas à 250 e 800 °C dispersas por nanoemulsão em comparação com o Controle (máxima viabilidade celular) após incubação de 24, 48 e 72 horas à 37 °C. *(p<0,05). (A) (B) e (C) representam a viabilidade celular para a NP calcinada à 250 °C, nos períodos de 24, 48 e 72 horas, respectivamente. (D) (E) e (F) correspondem à viabilidade da NP calcinada à 800 °C há 24, 48 e 72 horas, respectivamente.

100 aumentou levemente após 48h e 72h de incubação, conforme apresentado na figura 54(C).

Além disso, todas as concentrações se mostraram diferentes significativamente do controle (*p<0,05).

As figuras 54(D, E) apresentam os valores percentuais de viabilidade celular para as amostras ZnCo800 preparadas nas concentrações iguais à 1000 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL, 125 µg/mL e 62,5 µg/mL. Para amostras de ferrita Co800, preparadas em concentrações, que variaram entre 1000 µg/mL à 62,5µg/mL, os valores percentuais de viabilidade celular obtidos após 24h de incubação, permaneceram próximos à 30%. O valor percentual da viabilidade celular para a solução com concentração igual a 62,5 µg/mL foi próximo de 67%. A figura 54(E) mostra que o valor percentual da viabilidade aumentou para 50% para amostras preparadas com concentrações entre 1000 µg/mL à 125 µg/mL, obtidas após 48 h de incubação. O valor percentual da viabilidade celular para a solução com concentração igual a 62,5 µg/mL foi próximo de 63%, conforme apresentado na figura 54(E). A figura 54(F) mostra que o valor percentual da viabilidade era igual a 48% para amostras preparadas com concentrações entre 1000 µg/mL à 125 µg/mL, obtidas após 72 h de incubação. O valor percentual da viabilidade celular para a solução com concentração igual a 62,5 µg/mL foi próximo de 63%, conforme apresentado na figura 54(F). As figuras 54(E, F) sugerem que durante 48h e 72 h após a incubação, o percentual de viabilidade celular manteve-se estável. O aumento da temperatura de calcinação de 250 °C para 800 °C, aumentou levemente o valor percentual da viabilidade celular para as amostras incubadas após 48h e 72h, conforme representado pelas figuras 54(E, F). Todas as concentrações mostraram diferenças significativas do controle (*p<0,05).

Figura 55: Taxa de viabilidade celular pelas concentrações testadas das dispersões utilizadas em comparação com o Controle (máxima viabilidade celular) após incubação de 24, 48 e 72 horas à 37 °C.

*(p<0,05).

101 A figura 55, representa a viabilidade celular em contato com a dispersão utilizada, mostrando que em 24 horas variou de 32% e 66%, da maior para a menor concentração.

Em 48 horas, variou de 45% a 62% e em 72 horas 47% a 68%.

Os valores de CC50 foram demonstrados pela tabela 7, apresentada abaixo, em que se pode observar que não houve viabilidade acima de 70%, demonstrando que o material analisado é citotóxico, e o CC50 foi observado entre as concentrações de 125 – 62,5 µg/mL, ou seja, foi em torno destas concentrações que ele gerou redução da viabilidade celular à 50%.

CC50 (µg/mL)

Tempo de incubação

Ferrita 24h 48h 72h

Zn250 89,81 72,85 69,61

Zn800 101,9 84,40 94,52

Co250 70,69 69,19 72,57

Co800 73,11 73,16 67,75

ZnCo250 90,31 86,99 75,13

ZnCo 800 102,7 87,56 84,82

Dispersão 121,3 104,2 107,8

Tabela 7: Tabela referente aos valores de CC50 encontrados para os testes com as ferritas em contato com as células Vero.

A avaliação do efeito citotóxico em compostos naturais e sintéticos, são de fundamental papel para seleção de produtos menos nocivos. As linhagens de células Vero (células de rim de macaco verde Africano), têm sido utilizadas como modelo de culturas celulares na avaliação do efeito citotóxico pelo método de MTT. Esse método é usado para confirmar a viabilidade celular. Assim, a visualização da viabilidade celular ocorre a partir da redução do sal tetrazólio, que apresenta coloração amarela, em formazan, de coloração púrpura (MOSMANN, 1983).

Testes de citotoxicidade utilizando ferritas de manganês e zinco, em linhagem de células normais e cancerosas, mostraram que tais ferritas apresentam atividade citotóxica, principalmente nas linhagens de células cancerosas. Foi observado que a ferrita de zinco

102 em concentração de 0,2 mg/mL apresentou diminuição de 50% da sua viabilidade celular (IACOVITA et al., 2019).

Os nossos resultados aqui apresentados, embora realizados em células de linhagens diferentes, corroboram com os resultados deste estudo aqui apresentado para todas as ferritas. Para a ferrita de Zn250, foi obtido que a diminuição de 50% da sua viabilidade foi para amostras com concentração iguais a 89,81 µg/mL, 72,85 µg/mL e 69,61µg/mL, após 24, 48 e 72 horas, respectivamente. E para a ferrita Zn800, os valores de CC50 foram iguais a 101,9 µg/mL, 84,40 µg/mL e 94,52 µg/mL, após 24, 48 e 72 horas, respectivamente.

A viabilidade celular pelo método MTT em células Vero foi realizada por Bohara et al. (2017) para avaliar os efeitos citotóxicos de CoFe2O4 funcionalizadas com aminal.

Esse estudo revelou que a ferrita funcionalizada se mostrou biocompatível, pois teve porcentagem de viabilidade celular de 85% em concentrações de 1000 µg/mL. Outro estudo da ferrita de Zn0,9Fe2,1O4, sintetizada pelo método poliol, em contato com células do endotélio vascular umbilical mostrou alta viabilidade celular de 90 a 100% de biocompatibilidade em concentrações de 100 µg/mL (HANINI et al., 2016). Ambos estudos mostraram alta viabilidade celular, que em comparação ao estudo aqui exposto, o qual obteve baixa viabilidade, pode ter se mostrado pela não funcionalização das ferritas.

Estudo em linhagens celulares de pulmão, pele e fígado humanos, com ferritas de zinco comerciais (tamanho <100nm), em concentrações de 10-40 µg/mL, por 24 horas, mostrou indução de citotoxicidade como dose-dependente, da menor concentração para a maior, se teve uma variação entre as linhagens de 81 a 67% e 38 a 25% de diminuição da viabilidade celular. Os principais parâmetros para avaliar a biocompatibilidade da NP é o tamanho, forma, grau de cristalização, pureza, aglomeração, dispersão, entre outros.

(ALHADLAQ et al., 2015; NEL et al., 2006; MURDOCK et al., 2008). Este estudo apresentou menor viabilidade celular do que os resultados apresentados no presente trabalho.

Ensaios utilizando células Vero em contato com óxido de ferro, mostraram que NM é dose dependente, pois a viabilidade diminue conforme a concentração do NM aumentava (> 4 mmol/L). A justificativa desses resultados é de que conforme o aumento da concentração, ocorria a precipitação da ferrita no fundo do poço devido à aglomeração (OLIVEIRA, 2018).

103 Embora tenha sido apresentada diminuição da viabilidade celular pelo estudo acima citado, pode-se ressaltar que este demonstrou tais resultados devido às ferritas serem funcionalizadas. Ao contrário do presente trabalho, em que as ferritas não foram funcionalizadas, mas sim dispersas em nanoemulsão, e baixa viabilidade celular.

De acordo com Ramalho (2017) ensaios realizados em células Vero mostraram que para o óxido de gálio amorfo houve alta viabilidade, com porcentagem superior à 87% de concentrações entre 0,625 µg/mL à 5,0 µg/mL. Outro estudo, mostrou que algumas NPs podem ter alta citotoxicidade, como o caso de ensaios com NPs da prata coloidal que apresentaram viabilidade celular inferior a 20% em concentrações de 29 ppm e 58 ppm (PIGNATARO, 2020).

Devido aos resultados das ferritas dispersas terem sido muito parecidos com o da dispersão em si, houve a investigação do componente que desempenhou a ação citotóxica.

Dessa forma, segundo Yoo et al. (2013), o propileno glicol em cerca de 1000 à 31,25 µg/mL potencializou a ação citotóxica, com resultados inferiores a 20% de viabilidade celular, do composto inorgânico pirossulfito de sódio (Na₂S₂O₅) que apresentava citotoxicidade nessa porcentagem apenas até a concentração de 200 µg/mL.

Outro estudo em relação a citotoxicidade de componentes surfactantes de emulsões mostrou que são citotóxicas concentrações superiores à 0,3% de propileno glicol (LAM et al., 2019). Contudo, outro componente que apresenta citotoxicidade em concentrações acima de 0,05 v/v% (IC50) é o tween 80 (polisorbato 80), que em testes em células cancerosas (UJHELYI et al., 2012). Em estudo com óleo mineral, utilizando córnea de coelhos, mostrou que as nanoemulsões formadas não apresentaram citotoxicidade em concentração de número de partículas superior à 4,91 x 10¹², cujo a viabilidade ficou em torno de 100% (KATZER et al., 2014).

Pode-se verificar, com os estudos apresentados acima, que os componentes propileno glicol e tween 80 apresentam certo grau de citotoxicidade em concentrações próximas às utilizadas nesta pesquisa. Contudo, a partir dos resultados expostos neste trabalho, não foi possível avaliar a viabilidade celular decorrente da ação das ferritas, pois a nanoemulsão se mostrou citotóxica.

104