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Campus de Botucatu
RELATÓRIO CIENTÍFICO REFERENTE AO PÓS-DOUTORADO
AÇÃO DA PRÓPOLIS NA APRESENTAÇÃO ANTIGÊNICA E ATIVAÇÃO DIFERENCIAL DE LINFÓCITOS Th2 E Th17 HUMANOS
Pós-doutorando: Bruno José Conti
Depto. de Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biociências, UNESP, Campus de Botucatu
Supervisor: Prof. Dr. José Maurício Sforcin
Depto. de Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biociências, UNESP, Campus de Botucatu
Pedido PROPe: 1007 FAPESP: 2015/03409-2
Período coberto pelo relatório científico: 10/2015 a 07/2016
Botucatu – SP 2016
2 RESUMO
A própolis é um produto resinoso, elaborado pelas abelhas a partir de diversas partes das plantas, destacando-se por suas inúmeras propriedades farmacológicas e pela possibilidade de aplicação na indústria farmacêutica e alimentícia. A maioria dos trabalhos publicados sobre própolis e imunidade foi realizada com animais e poucos são os trabalhos com humanos no tocante à sua ação imunomoduladora. Recentemente, iniciamos estudos com células humanas, avaliando o efeito da própolis em monócitos e células dendríticas e, neste projeto, visamos investigar os mecanismos celulares modulados pela própolis na apresentação de antígenos e ativação diferencial de linfócitos Th2 e Th17. Para tal, utilizamos um antígeno infeccioso (subunidade B da enterotoxina termolábil de Escherichia coli) e lipopolissacarídeo (LPS), e inicialmente avaliamos a expressão de marcadores celulares (TLR-2, TLR-4, HLA-DR, CD80, CD40) e produção de citocinas (TNF-α, IL-6, IL-10 e IL-12) por monócitos. Também será analisada, no próximo semestre, a ativação de expressão de fatores de transcrição (NF-kB e STAT-3), proliferação de linfócitos, a expressão de fatores de transcrição (GATA-3 e RORγt) e produção de citocinas (IL-4 e IL-17) por linfócitos T, no intuito de investigar se a própolis poderia favorecer um perfil de ativação, culminando preferencialmente no perfil Th2 ou Th17. Os resultados obtidos até o momento, evidenciaram que o tratamento com a própolis e os antígenos, não afetaram a viabilidade dos monócitos humanos. Com base neste resultados, será possível dar continuidade aos ensaios propostos para este projeto adotando todas as concentrações analisadas e verifica-las nos seguintes protocolos: expressão de marcadores celulares, produção de citocinas, fatores de transcrição e a ativação diferencial de linfócitos T. Assim, estes achados serão inéditos e relevantes, pois tal protocolo poderá ser adotado em esquemas vacinais ou tratamento de doenças inflamatórias/autoimunes, evidenciando assim a implicação prática deste projeto de pesquisa.
Palavras-chave: própolis; monócito; linfócito; imunomodulação; produtos naturais
3 1. Introdução
Própolis é um produto resinoso e balsâmico, coletado e elaborado pelas abelhas a partir de algumas partes de plantas como brotos, ramos, cascas de árvores, exsudados resinosos e botões florais, ao qual as abelhas adicionam secreções salivares, cera e pólen (BANKOVA, 2005). As abelhas utilizam a própolis para selar aberturas e controlar variações de temperatura no interior da colméia. A própolis também é utilizada para embalsamar insetos e outros invasores que morrem no interior da colméia, para evitar sua decomposição e manter o ambiente interno asséptico, protegendo-o contra micro-organismos (SALATINO et al., 2005). A própolis tem se destacado devido às suas inúmeras propriedades biológicas e farmacológicas, e pela possibilidade de aplicação na indústria farmacêutica e alimentícia, embora seja utilizada na medicina desde a antiguidade (SALATINO et al., 2005).
Há 20 anos, iniciamos os estudos sobre própolis, desde então, inúmeros trabalhos foram realizados por nosso grupo, visando investigar principalmente suas ações imunomoduladora, antimicrobiana e antitumoral (SFORCIN et al., 2000; MURAD et al., 2002; ORSI et al., 2005;
SFORCIN, 2007; ORSATTI et al., 2010; WATANABE et al., 2011; BÚFALO et al., 2013).
Também verificamos a ausência de efeito colateral após administração de própolis a curto ou longo prazo a ratos (SFORCIN et al., 1995; SFORCIN et al., 2002; MANI et al., 2006).
Décadas atrás, eram escassos os artigos encontrados na literatura pertinente sobre este produto apícola. Nos últimos anos, os pesquisadores demonstraram enorme interesse em investigar sua composição química e propriedades biológicas, havendo considerável avanço no conhecimento científico sobre este apiterápico.
A própolis é composta por 50% de resina, 30% de cera de abelha, 10% de óleos aromáticos e essenciais, 5% de pólen e 5% de outras substâncias variadas, além de impurezas (BURDOCK, 1998). A coloração da própolis pode variar entre amarelo claro, vermelho escuro, verde e até marrom, dependendo da sua origem botânica (SALATINO et al., 2005). Sua composição química é extremamente complexa, variando conforme a localização geográfica e a flora local. As principais fontes de própolis no apiário da UNESP, Campus de Botucatu, são Baccharis dracunculifolia DC (alecrim-do-campo), seguida de Araucaria angustifolia (Bert.) O.
Kuntze e Eucalyptus citriodora Hook (BANKOVA et al., 1999). Os constituintes da própolis como materiais cerosos, bálsamos, óleos essenciais e derivados fenólicos, podem ser extraídos
4 em solventes como etanol, éter, acetona, tolueno e tricloroetileno (CUNHA et al., 2004). Foram identificados mais de 300 componentes presentes na própolis; destes, os principais componentes biologicamente ativos da própolis brasileira são os ácidos diterpênicos e ácidos p-cumáricos prenilados. Há também chalconas, ácido benzóico, benzoaldeído, álcoois, acetona, compostos fenólicos, ácido cinâmico, ácido cafeico e derivados, di- e triterpenos (DE CASTRO, 2001).
Os compostos presentes na própolis produzida no apiário da UNESP, Campus de Botucatu, foram analisados por cromatografia gasosa (GC), cromatografia gasosa associada à espectrometria de massa (GC-MS) e cromatografia em camada delgada (TLC), revelando que seus principais grupos são: compostos fenólicos (flavonóides, ácidos aromáticos, benzopiranos) di- e triterpenos, óleos essenciais, entre outros. Os flavonóides estão presentes em pequenas quantidades (4’-O-metil canferol, 5,6,7-trihidroxi-3,4’dimetoxiflavona, aromadendrina-4’-metil éter); ácido p-cumárico prenilado e dois benzopiranos: E e Z 2,2-dimetil-6-carboxietenil-8- prenil-2H-benzopiranos); óleos essenciais (espatulenol, (2Z, 6E)-farnesol, benzoato de benzila e acetofenonas preniladas); ácidos aromáticos (ácido diidrocinâmico, ácido p-cumárico, ácido ferúlico, ácido cafeico, ácido 3,5-diprenil-p-cumárico, 2,2-dimetil-6-carboxi-etenil-8-prenil-2H- 1-benzo-pirano) (BANKOVA et al., 1998; SFORCIN, 2007). Dados de nosso grupo evidenciaram que variações sazonais na composição da própolis não são significativas, havendo concentrações dos compostos biologicamente ativos em todas as estações do ano (BOUDOUROVA-KRASTEVA et al., 1997; SFORCIN, 2007).
Com relação ao sistema imunológico, a própolis modula os eventos iniciais da resposta imune em camundongos, induzindo a expressão de Toll-like receptor TLR-2 e TLR-4 e produção de citocinas pró-inflamatórias (ORSATTI et al., 2010), bem como a geração de espécies reativas do oxigênio (H2O2) por macrófagos peritoneais (ORSI et al., 2000). A própolis também induz aumento na atividade fungicida de macrófagos contra Paracoccidioides brasiliensis (MURAD et al., 2002) e na atividade bactericida contra Samonella Typhimurium, envolvendo a participação de intermediários reativos do oxigênio e do nitrogênio (ORSI et al., 2005). Entretanto, a maioria dos trabalhos publicados sobre própolis e imunidade foi realizada com animais e, mais recentemente, iniciamos os estudos com monócitos e células dendríticas humanos (CONTI et al., 2013; BÚFALO et al., 2014).
Monócitos/macrófagos são células do sistema fagocítico mononuclear, sendo de fundamental importância na imunidade inata do hospedeiro. Monócitos podem ser distinguidos
5 dos macrófagos por vários critérios, além de sua localização, por estarem no sangue, enquanto macrófagos estão nos tecidos. Monócitos possuem citoplasma e núcleo menores, maior conteúdo de mieloperoxidase e níveis menores de esterases não específicas. Funcionalmente, são menos aderentes e possuem atividade fagocitária menor. Expressam menor número de antígenos de histocompatibilidade de classe II e de receptores para porção Fc de imunoglobulinas ou para o componente C3 do sistema complemento. No entanto, as diferenças entre monócitos e macrófagos são mais quantitativas do que qualitativas, sendo comumente difícil a diferenciação entre as duas células (WILTROUT & VARESIO, 1991).
O reconhecimento de antígenos através de receptores celulares, seu processamento e apresentação são eventos críticos para o desencadeamento de uma resposta imunológica, e os fagócitos elaboram respostas aos seus alvos de acordo com seu microambiente e presença de determinadas citocinas (DJALDETTI et al., 2002; FREEMAN & GRISTEIN, 2014).
Os TLRs reconhecem micro-organismos através da detecção de produtos ou estruturas microbianas conservadas, denominados de padrões moleculares patógeno-associados (PAMPs).
Os PAMPs estão ausentes em células eucarióticas, mas podem estar presentes tanto em micro- organismos patogênicos ou não, fazendo com que os TLRs sejam capazes de distinguir o próprio do não-próprio (MEDZHITOV, 2001). TLRs reconhecem um diverso, porém limitado, número de PAMPs. Como exemplo, TLR-2 reconhece uma grande quantidade de produtos microbianos, como peptidioglicanos, lipopolissacarídeos (LPS) de bactérias Gram-negativas, lipoproteínas, componentes de parede celular de micobactérias, dentre outros. Tal variedade de ligantes pode ser explicada, em parte, pela cooperação existente entre TLR-2 e TLR-1 ou TLR-2 e TLR-6, ocorrendo formação de heterodímeros. Já TLR-4 tem como agonistas LPS de bactérias Gram- negativas, ácido lipoteicóico e a proteína de fusão F do vírus respiratório sincicial (RSV). Ácidos nucléicos virais ou bacterianos são reconhecidos por TLR-3/7/8 e 9 enquanto o TLR-5 tem como ligante a flagenina bacteriana (TAKEDA & AKIRA, 2005).
Após reconhecimento de micro-organismos, há ativação de vias de transdução de sinal, ativação de vários fatores de transcrição, como, por exemplo, NF-kB e STAT-3, relacionados à expressão gênica de TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-10. A via de sinalização do NF-kB é tipicamente pró-inflamatória, podendo ser ativada por inúmeros estímulos intra- ou extracelulares e levando à produção de citocinas como TNF-α e IL-1β.
6 A IL-6 pode ser regulada por múltiplos fatores de transcrição, incluindo NF-kB e AP-1 (HUNGNESS et al., 2000). Embora a IL-10 ative STAT-3, evidências revelam que a produção desta citocina pode ser controlada por STAT-3 (STAPLES et al., 2007). Estudos recentes demonstraram que a via STAT pode ser um alvo no controle da tumorigênese, incluindo linfomas e leucemias, embora os mecanismos de ação ainda apresentem falhas e sucessos quanto à inibição de STAT-3 (MUNOZ et al., 2014). Individualmente ou em combinação, as citocinas interagem com seus receptores específicos, modulando a função celular. Citocinas como o TNF- são importantes no processo de ativação de monócitos e macrófagos, enquanto que outras citocinas, como a IL-10, são consideradas fatores de desativação celular. Durante a inflamação, há níveis elevados de TNF- e IL-1, os quais também atuam como pirógenos endógenos. A IL-6 está envolvida não somente na resposta imunológica, apresentando ações pró- e anti-inflamatórias, como também em processos regenerativos, na regulação do metabolismo, na manutenção óssea e funções neurais (SCHELLER et al., 2011). A IL-12 é uma citocina com importante função no início e regulação da resposta imune celular, e possui capacidade de promover a diferenciação de células T naïve em Th1 produtoras de IFN-γ, as quais são fundamentais para o desenvolvimento da imunidade celular e resistência contra patógenos intracelulares.
Os ativadores de transcrição induzem também a expressão de genes envolvidos na resposta imune do organismo, como quimiocinas, moléculas de histocompatibilidade (MHC), moléculas co-estimulatórias importantes para ativação das células T, como CD80 (B7-1) que se liga ao CD28, e CD40, a qual atua como uma molécula transmembrânica sinalizadora, levando à ativação de fatores de transcrição, regulando um amplo espectro de processos moleculares e celulares, incluindo o início e progressão das respostas adaptativas celular e humoral (MEDZHITOV, 2001; HAN et al., 2003).
Monócitos apresentam antígenos aos linfócitos T via MHC (I ou II), fornecendo o primeiro sinal para ativação dos linfócitos T, e também expressam moléculas co-estimulatórias (B7-1, B7-2), propiciando o segundo sinal para ativação destas células, além de secretarem citocinas que determinam o perfil de linfócito efetor gerado após a ativação. Há várias subpopulações de linfócitos descritas, que podem ser classificadas pelos fatores de transcrição envolvidos e perfil de citocinas que produzem após ativação para exercerem suas funções efetoras (perfis Th1, Th2, Th17, Treg, entre outras).
7 Recentemente, HELMSTETTER et al. (2015) relataram que a expressão probabilística de citocinas por células Th diferenciadas ainda não está completamente elucidada.
As células naїve, sob processo de ativação, se diferenciam em células T efetoras com funções e padrões de citocinas específicas. O paradigma Th1/Th2 tem sido reavaliado e uma terceira população de células T efetoras produtoras de IL-17 denominadas de Th17 foi descrita mais recentemente (KORN et al., 2009).
O perfil Th2 está envolvido em resposta a patógenos extracelulares, incluindo helmintos, e a alérgenos, com a participação de eosinófilos e mastócitos que são fontes de IL-4. Esta ativa o fator de transcrição STAT-6, o qual, juntamente com os sinais advindos do TCR, induz a expressão de GATA-3, que é o fator regulador na diferenciação para Th2, por aumentar a síntese de citocinas como IL-4, IL-5 e IL-13. Experimentos com camundongos knockout confirmaram o importante papel do GATA-3 na diferenciação e proliferação de células Th2, bem como na inibição da diferenciação de células Th1 (ZHU et al., 2006).
As células Th17 são potentes indutoras de inflamação tecidual e têm sido implicadas na patogênese de muitas doenças autoimunes e condições inflamatórias (KORN et al., 2009).
Patógenos distintos como bactérias Gram-positivas, Gram-negativas, Mycobacterium tuberculosis e fungos como Pneumocystis carinii e Candida albicans podem desencadear uma forte resposta Th17, importante para a defesa do hospedeiro contra estes micro-organismos (BEADLING & SLIFKA, 2006). O envolvimento do perfil Th17 também tem sido descrito na patogênese de diversas doenças autoimunes, não só em vários modelos animais, bem como em doenças autoimunes humanas. Dentre as doenças descritas em animais de experimentação, temos a colite autoimune (ELSON et al., 2007), encefalomielite experimental autoimune (LANGRISH et al., 2005), artrite induzida por colágeno (CIA) (NAKAE et al., 2003), e a artrite induzida por adjuvante em ratos (AIA) (BUSH et al., 2002). Estudos têm demonstrado que a inibição do desenvolvimento de células Th17 no início da doença, através da neutralização da IL-6, suprime o desenvolvimento de CIA (FUJIMOTO et al., 2008).
As células Th17 requerem citocinas especificas e fatores de transcrição para sua diferenciação. Estas células são estimuladas pela produção de IL-6 e TGF-β em resposta à inflamação por bactérias extracelulares, e o principal fator da diferenciação das Th17 é o RORγt.
As células Th17 secretam citocinas da família IL-17 (em particular a IL-17A), e estão associadas a inflamações crônicas e neutrofilia intensa. De fato, MEASE (2015) relatou que antígenos
8 microbianos ou mesmo a desregulação imunológica podem induzir aumento na expressão de citocinas como a IL-23, a qual estimula a diferenciação e ativação das células Th17 e outras células da imunidade inata, favorecendo a resposta adaptativa e doenças inflamatórias crônicas.
Assim, o RORγt pode ser considerado um importante alvo para o tratamento de desordens inflamatórias (SKEPNER et al., 2014). Embora as células Th17 tenham surgido como uma população de células essenciais em processos inflamatórios e na patogênese de doenças auto- imunes, pouco se sabe sobre a modulação destas células por produtos naturais.
Neste projeto, os fatores de transcrição serão analisados por RNA-seq. Transcriptome shotgun sequencing (RNA-seq) é uma metodologia moderna baseada em análises de seqüenciamento de alto rendimento do RNA, permitindo a contagem sistemática de todos os transcritos do gene. Sua análise é fundamental para o conhecimento dos constituintes moleculares de células e tecidos, e interpretação dos elementos funcionais do genoma. A metodologia de RNA-seq pode ainda fornecer informações adicionais quanto à complexidade do genoma em questão, assim como um grande espectro de RNAs não codificadores. Outra vantagem é a maior sensibilidade e identificação de genes ainda desconhecidos (WOLF, 2013).
Diante destas observações, o presente projeto foi delineado visando avaliar a ação moduladora da própolis nos mecanismos envolvidos na apresentação de antígenos e possível ativação diferencial de linfócitos T humanos. Para tal, utilizamoa um antígeno infeccioso (subunidade B da enterotoxina termolábil de E. coli) (NORTON et al., 2012), e o lipopolissacarídeo (LPS) (JACQUIER et al., 2015), no intuito de investigar se a própolis poderia favorecer um perfil de ativação, culminando preferencialmente no perfil Th2 ou Th17, analisando a produção de citocinas e expressão de fatores de transcrição. Estudos têm apontado que a enterotoxina termolábil de E. coli (LTB) é capaz de induzir resposta imune humoral, estimulando a produção de anticorpos contra antígenos co-administrados ou fusionados (GREEN et al., 1996, VERWEIJ et al., 1998, WELTZIN et al. 2000; CONCEIÇÃO et al., 2006;
FINGERUT et al., 2006; PITCOVSKI et al., 2006). Além de a LTB ativar a diferenciação seletiva de linfócitos (WILLIAMS, 2000), influencia também a maturação e ativação de células dendríticas (PETROVSKA et al., 2003; PITCOVSKI et al., 2006) e aumenta a apresentação de antígenos via MHC classe II (NASHAR; et al., 2001), sendo estas as bases de seu efeito imunoestimulatório (FINGERUT et al., 2006).
9 Assim, partimos do pressuposto de que a apresentação antigênica e ativação de linfócitos T poderiam ser moduladas pela própolis, culminando, por exemplo, na resposta imune humoral contra antígenos extracelulares, ou na resposta inflamatória/autoimune em função do perfil de linfócitos T gerado (Th2 ou Th17). Tais achados serão inéditos e relevantes, pois tal protocolo poderá ser adotado em esquemas vacinais ou no tratamento de doenças inflamatórias/autoimunes, evidenciando assim a implicação prática deste projeto de pesquisa.
2. Objetivos
Verificar o possível efeito citotóxico da própolis e dos antígenos sobre monócitos de indivíduos saudáveis;
Analisar a ação da própolis simultaneamente ou não com os antígenos sobre a expressão de marcadores de superfície celular (TLR-2, TLR-4, HLA-DR, CD80, CD40) em monócitos, por citometria de fluxo;
Avaliar a produção de citocinas pró- e anti-inflamatórias (TNF-, IL-6, IL-10 e IL- 12), por ensaio imunoenzimático (ELISA);
Realizar a análise de expressão diferencial de RNAm pela técnica de RNA-seq (transcriptoma) após o tratamento de monócitos dando ênfase às vias de ativação NF- kB e STAT-3;
Avaliar a proliferação de linfócitos após co-cultura com monócitos tratados com própolis simultaneamente ou não com os antígenos;
Avaliar o perfil transcricional dos linfócitos T, dando atenção ao perfil (Th2 e Th17) através da avaliação sequencial da expressão dos fatores por RNA-seq;
Analisar o perfil de citocinas (IL-4 e IL-17) produzidas por linfócitos T por citometria de fluxo.
10 3. Etapas realizadas no período coberto pelo relatório
3.1. Material e Métodos
3.1.1. Obtenção da amostra de própolis e antígenos
A própolis foi produzida por abelhas africanizadas (Apis mellifera L.), no apiário da Fazenda Experimental Lageado, (UNESP, Campus de Botucatu). As amostras foram obtidas em telas propolisadoras congeladas para facilitar a remoção da própolis. Em seguida, a própolis foi triturada e extraída (30 g de própolis para 100 mL de etanol 70%), em ausência de luz e sob moderada agitação. Após 7 dias, os extratos foram filtrados e foi calculada a concentração final, para obter o peso seco da solução (SFORCIN et al., 2005).
A própolis foi diluída em meio RPMI completo (Cultilab, Brasil), contendo 0,1 g/L de L- glutamina, 2,2 g/L de bicarbonato de sódio, 10 mL/L de aminoácidos não essenciais e suplementado com 10% de soro fetal bovino (Cultilab, Brasil). Após filtração, foram realizadas diluições para se obter as concentrações de 5 e 25 g/mL de própolis, plaqueando o volume final de 100 µL na placa de 96 poços. Os mesmos procedimentos foram realizados com o álcool 70%
(solvente da própolis) para se obter 0,03 e 0,15% de álcool (volumes correspondentes ao teor de álcool 70% nas concentrações de 5 e 25 g/mL de própolis, respectivamente) (BÚFALO et al., 2009).
Os antígenos, subunidade B da enterotoxina termolábil de E. coli, (2 e 10μg/mL) e LPS (1 e 5μg/mL) foram adquiridos comercialmente da Sigma-Aldrich (EUA), e as concentrações utilizadas foram padronizadas em experimentos-piloto.
3.1.2. Obtenção de monócitos humanos
O sangue foi obtido de 10 indivíduos voluntários saudáveis, que assinaram um termo de consentimento para retirada de sangue, dando ciência desta pesquisa. Foram aceitos indivíduos acima de 18 anos, não fumantes e que não estavam doentes e nem utilizando medicação de espécie alguma. Tais indivíduos foram informados desta pesquisa através de cartazes afixados
11 nos murais do Instituto de Biociências, e participaram desta pesquisa somente aqueles que tiveram interesse por livre e espontânea vontade.
Amostras de sangue (20 mL) foram coletadas e colocadas em tubos estéreis contendo 200µL de heparina. Posteriormente, os monócitos foram obtidos por separação em gradiente de Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Suécia) através de centrifugação e o anel rico em células mononucleares foi coletado e lavado 2 vezes em meio RPMI por 10 minutos a 200 x g. Em seguida, o sobrenadante foi desprezado e o pellet de células ressuspendido em 1 mL de RPMI completo. A identificação dos monócitos foram realizadas através da incorporação de vermelho neutro a 0,02% durante 8 minutos a 37ºC. Após contagem em câmara de Neubauer, a concentração celular foi ajustada para 1 x 106 células/mL, e 100 L foram adicionados em cada poço da placa de cultura celular de 96 wells, incubando a 37ºC e 5% de CO2 por 2h para aderência dos monócitos. Após este período, as células aderentes foram incubadas com própolis, simultaneamente ou não os antígenos por 24 h.
3.1.3. Viabilidade de monócitos após incubação com própolis e os antígenos
Após o período de 24h de incubação das células com a própolis e os antígenos a viabilidade celular foi analisada através do método de MTT {brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2- il)-2,5-difeniltetrazólio]} (Sigma-Aldrich, EUA). O princípio deste método consiste na absorção do sal MTT pelas células viáveis, o qual é reduzido no interior da mitocôndria a formazan. Após o período de incubação, foi retirado o sobrenadante da cultura e adicionado 100 µL do MTT na concentração de 1 mg/mL em meio RPMI completo, incubando novamente as células por mais 3h. Após a incubação, o sobrenadante foi retirado cuidadosamente e adiciona-se 100 µL de dimetilsulfóxido (DMSO). Em seguida, as absorbância correspondente a cada amostra foi obtida em leitor de ELISA, utilizando-se o filtro de 540 nm (NAJAFI et al., 2007). A absorbância obtida das células controle (não tratadas) foi considerada como 100% de viabilidade celular.
3.1.4. Cultura de monócitos para avaliação de marcadores de superfície, vias de sinalização e dosagem das citocinas
12 As culturas de monócitos, contendo 1 x 106 células/mL, foram incubadas com as concentrações de própolis que não apresentarem citotoxicidade e com os antígenos. Após 24 h, os sobrenadantes foram coletados e armazenados a –70ºC para posterior dosagem de citocinas, e as células foram utilizadas para avaliação dos marcadores de superfície e vias de sinalização.
3.1.5. Avaliação de marcadores de superfície celular por citometria de fluxo
Nos ensaios de citometria de fluxo, utilizaremos o citômetro de fluxo modelo FACS CaliburTM (BD Becton Dickinson and Company, EUA).
Para avaliação da presença dos seguintes marcadores celulares: TLR-4, TLR-2, HLA-DR, CD80 e CD40, as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) contendo 5 x 105 monócitos/500 L foram colocadas em tubos Falcon de poliestireno para citômetro e centrifugadas por 10 minutos a 1700 rpm. O sobrenadante foi descartado e as culturas foram incubadas por 24 horas a 37ºC com a própolis simultaneamente ou não com os antígenos. Em seguida, as células foram lavadas, ressuspendidas em 1 mL de solução eletrolítica (ISOTON II) e incubadas com os anticorpos monoclonais fluoresceinados específicos. As células foram separadas em dois grupos (A e B). As células foram marcadas com 5 µL anti-CD14 conjugado com PerCP/Cy5.5 (clone HCD14 - Biolegend, EUA), o que permitirá a seleção do gate apenas dos monócitos CD14+. No grupo A, as células estimuladas foram incubadas com 5 µL dos anticorpos anti-TLR-2 conjugado com FITC (clone TL2.1 - Biolegend, EUA) e anti-TLR-4 conjugado com PE (clone HTA125 - Biolegend, EUA). No grupo B, os monócitos foram incubados com 5 µL dos anticorpos anti-HLA-DR conjugado com FITC (clone L243 - Biolegend, EUA), anti-CD80 conjugado com PE (clone D210 - Biolegend, EUA) e anti-CD40 conjugado com APC (clone 5C3 - Biolegend, EUA). Para cada teste, foi incluído um tubo controle onde as células foram incubadas com 5 µL dos anticorpos de controle isotípico marcados com os respectivos fluorocromos dos testes (PE, FITC, PerCP/Cy5.5 e APC – Biolegend, EUA) durante 30 minutos ao abrigo da luz à 4ºC. Após a incubação, as células foram centrifugadas por 10 minutos a 1700 rpm para lavagem com 50 L de paraformaldeído 5%, ressuspendidas em 450 L de ISOTON II e analisadas por citometria de fluxo (NAKAIRA- TAKAHAGI et al., 2011).
As análises foram realizadas utilizando o software CellQuest para adquirir e analisar multiparâmetros celulares. Foi padronizada a aquisição de 30.000 eventos (no gate) por amostra
13 e otimizada a população de interesse, estabelecendo gate com base em parâmetros de tamanho (FSC) e granulosidade (SSC). Os resultados foram expressos em percentual de células CD14 positivas. (NAKAIRA-TAKAHAGI et al., 2011).
3.1.6. Determinação de citocinas pela técnica de ELISA
A determinação da concentração de TNF-α, IL-6, IL-10 e IL-12 foi realizada através de ensaio imunoenzimático (ELISA). Inicialmente foram adicionados 100 µL de salina tamponada com fosfato (PBS) e anticorpos monoclonais diluídos conforme instruções do fabricante (R&D Systems, EUA) às placas de poliestireno (Maxisorp-Nunc, EUA), e incubadas overnight a 4ºC em câmera úmida. Após 3 lavagens dos poços com PBS acrescido de Tween 20 (0,05%), ocorrerá o bloqueio dos poços com albumina sérica bovina (Sigma-Aldrich, EUA) em PBS (10%) para saturação dos sítios de ligação e, em seguida, a placa foi incubada a temperatura ambiente por 1h. A seguir, nova seqüência de lavagens foi realizada e alíquotas de 100 µL dos sobrenadantes das culturas de células foram adicionadas com posterior incubação por 2 h a temperatura ambiente. Os poços foram novamente lavados e, ao anticorpo de detecção policlonal biotinilado, foi adicionado o conjugado estreptoavidina-peroxidase, incubando-se novamente por 20 min. Novas lavagens foram realizadas e, para revelação, foram adicionados 100 µL da solução contendo o substrato peróxido de hidrogênio e tetrametilbenzidina. Após 20 minutos a temperatura ambiente, a reação enzimática foi interrompida pela adição de 50 µL de H2SO4 2N.
As leituras foram realizadas em leitor de ELISA com filtro de 490 nm.
3.1.7 Análise estatística
A análise dos dados foi realizada através do software Graph Pad Prism 5 (GraphPad San Diego, USA) utilizando-se a Análise de Variância (ANOVA) para medidas repetidas, seguida do teste de comparações múltiplas de Dunnett (p<0,05).
3.2. Resultados e discussão
14 A própolis tem sido objeto de investigação do nosso grupo de pesquisa há quase duas décadas. Este material resinoso e balsâmico, coletado e elaborado pelas abelhas a partir de diversas partes das plantas tem despertado o interesse de vários pesquisadores por possuir inúmeras propriedades biológicas tais como: imunomoduladora, antimicrobiana, anti- inflamatória, antioxidante, entre outras (SFORCIN, 2007; SFORCIN & BANKOVA, 2011). A maioria dos trabalhos publicados sobre própolis e imunidade foi realizada com animais e poucos são os trabalhos com humanos no tocante à sua ação imunomoduladora.
Este projeto de pós-doutorado é parte de um projeto maior que foi delineado para dar continuidade aos achados prévios junto à nossa linha de pesquisa, visando responder inúmeras indagações sobre o papel da própolis na modulação antigênica e na diferenciação de linfócitos T humanos. A princípio este trabalho foi discutido em janeiro de 2015 com a Profa. Dra. Maria Teresa Cruz, da Universidade de Coimbra, Portugal, amadurecendo as ideias iniciais e propondo objetivos inéditos, pois a realização deste projeto trará importantes contribuições não só em relação à ação imunomoduladora da própolis, como também poderá trazer inovação quanto à sua ação adjuvante em esquemas vacinais, ou no tratamento de doenças inflamatórias/autoimunes, evidenciando assim a implicação prática desta investigação, o que pode ser de interesse para centros de pesquisa, bem como para a indústria farmacêutica futuramente.
Inicialmente, determinamos a padronização das concentrações e os grupos de tratamento dos nossos ensaios com bases nos dados da literatura. Posteriormente incubamos os monócitos humanos com diferentes concentrações de própolis (5 e 25 μg/mL) simultaneamente ou não com a toxina termolábil de E. coli (2 e 10 μg/mL) por 24 h. Desta forma avaliamos o possível efeito deste apiterápico em conjunto ou não com o antígeno sobre a viabilidade destas células. Os resultados permitiram concluir que a metodologia adotada foi eficiente e que em nenhuma das concentrações de própolis ou da toxina termolábil de E. coli utilizadas neste ensaio afetou a viabilidade dos monócitos humanos (figura 1).
15 Enterotoxina de Escherichia coli
Controle Etan
ol Própolis 5
Própolis 25 E. coli 2
E2 + P5 E2 + P25
E. coli 10 E10 + P5
E10 + P25 Água 0
20 40 60 80 100 120
Viabilidade celular (%)
Figura 1. Viabilidade (%) de monócitos humanos após incubação com diferentes concentrações de própolis (P) (5 e 25μg/mL), E. coli (E) (2 e 10μg/mL), Etanol, Água ou Controle (meio de cultura) por 24 h. Os dados representam a média e o desvio padrão de 10 ensaios similares.
A necessidade em melhorar a eficácia das vacinas existentes e/ou o desenvolvimento de novas vacinas tem sido suplementado pela utilização de adjuvantes. A subunidade B da enterotoxina termolábil de Escherichia coli (LTB) tem se destacado pela sua capacidade adjuvante sendo capaz de aumentar a reposta imune humoral e celular antígeno-específicas (WELTZIN et al., 2000; WILLIAMS, 2000, ROCHA et al., 2008, FISCHER et al., 2010).
Neste contexto, estudos têm apontado a LTB como um adjuvante completo, capaz de induzir resposta imune celular, incluindo células T citotóxicas (SIMMONS et al., 2001), e humoral, estimulando resposta sistêmica e secretória de anticorpos contra antígenos co- administrados ou fusionados (GREEN et al., 1996, VERWEIJ, et al., 1998, WELTZIN et al., 2000, CONCEIÇÃO et al., 2006, FINGERUT, 2006, PITCOVSKI et al., 2006).
A LTB também ativa a diferenciação seletiva de linfócitos (WILLIAMS, 2000), influencia na maturação e ativação de células dendríticas (PETROVSKA et al., 2003, PITCOVSKI et al., 2006) e aumenta a apresentação de antígenos via MHC classe II (NASHAR et al., 2001, BONE et al., 2002). Acredita-se que estas sejam a base de seu efeito imunoestimulatório (FINGERUT et al., 2006).
16 A utilização de antígenos associados a substâncias adjuvantes, como exemplo os produtos naturais pode modificar ou aumentar a potência da resposta imune humoral e/ou celular, assim prolongando a reposta para uma maior eficácia e proteção do sistema imune. Desta forma, em nossos ensaios as concentrações utiliadas da LTB, não influenciou na viabilidade dos monócitos, sugerindo a utilização das mesmas nos próximos protocolos deste projeto.
Dando continuidade aos ensaios, realizamos a incubação dos monócitos humanos com diferentes concentrações de própolis (5 e 25 μg/mL) simultaneamente ou não com o LPS (1 e 5 μg/mL) por 24 h. Tal como nos resultados com LTB, não observamos efeito citotóxico na incubação destas células com nenhuma das concentrações empregadas de LPS, conforme representado na figura 2.
Lipopolissacarídeo
Controle Etan
ol Própolis 5
Própolis 25 LPS 1
L1 + P5 L1 + P25
LPS 5 L5 + P5
L5 + P25 0
20 40 60 80 100 120
Viabilidade celular (%)
Figura 2. Viabilidade (%) de monócitos humanos após incubação com diferentes concentrações de própolis (P) (5 e 25μg/mL), LPS (1 e 5 μg/mL), Etanol ou Controle (meio de cultura) por 24 h. Os dados representam a média e o desvio padrão de 10 ensaios similares.
As bactérias Gram-negativas possuem em sua membrana externa o LPS, que desempenha importante função na viabilidade bacteriana e na interação com o hospedeiro. Esta molécula é considerada uma das mais potentes iniciadoras de inflamação, sendo o sistema imune inato capaz de detectar concentrações mínimas de LPS no organismo (GIOANNINI et al., 2004).
17 O LPS liga-se a “proteína ligante de lipopolissacarídeo” (LBP) presente no soro, formando o complexo LPS-LBP (SCHUMANN et al., 1990). Este complexo liga-se ao receptor CD14, expresso principalmente em monócitos e macrófagos, desencadeando uma cascata de proteínas de sinalização intracelular como o NF-кB e o MyD88, culminando na ativação de genes responsáveis pela produção de citocinas inflamatórias (TAKEDA & AKIRA, 2005).
Deste modo, esta molécula desempenha papel importante na ativação inicial de monócitos e macrófagos no desenvolvimento da resposta inflamatória. Afirmando o importante papel implicado no emprego do LPS em esquemas vacinais ou como adjuvante na modulação da resposta imunologica.
Dando continuidade, realizamos também os ensaios de citotoxicidade com o álcool 70%
(solvente da própolis) (Figura 1) bem como água destilada estéril (solvente da toxina termolábil de E. coli) (Figura 2), para descartar a possibilidade da interferência do mesmo na viabilidade celular. Reforçando achados de modelos experimentais adotados anteriormente por nosso grupo, verificamos que o álcool 70% e a água não afetaram a viabilidade celular em nenhuma das concentrações utilizadas
Diante dos resultados obtidos com a viabilidade celular, foi possível dar continuidade aos experimentos, adotando todas as concentrações previstas de própolis e dos antígenos. Assim, até o momento, analisamos a ação destas variáveis sobre a produção de citocinas e expressão de receptores celulares. Estes experimentos encontram-se em fase de finalização, bem como a análise dos dados prévios.
Paralelo a essas atividades pude acompanhar e executar alguns protocolos realizados no nosso laboratório, juntamente com uma Pós-Doutoranda Karina Basso Santiago e uma mestranda Fernanda Lopes Conte delineamos alguns ensaios biológicos, ao qual o meu projeto se enquadra, como parte integrante de um projeto de pesquisa maior.
No tocante, à escolha dos antígenos a serem utilizados no projeto, realizei a padronização das concentrações de MAGE-1 e ácido retinóico, dois outros antígenos que serão utilizados em combinação ou não como a própolis para verificar o efeito imunomodulador deste apiterático na ativação diferencial de linfócitos T. Assim, foi possível com os ensaios de viabilidade celular, verificar que as concentrações sugeridas inicialmente não afetaram a viabilidade dos monócitos humanos, desta forma adotando os mesmos nos próximos ensaios deste projeto.
18 Com base nos dados expostos e na ausência de informações sobre o papel da própolis na modulação antigênica e na diferenciação de linfócitos T humanos, a realização deste projeto trará importantes contribuições não só em relação à ação imunomoduladora da própolis, como também poderá trazer inovação quanto à sua ação adjuvante em esquemas vacinais, ou no tratamento de doenças inflamatórias/autoimunes, evidenciando assim a implicação prática deste projeto de pesquisa, o que pode ser de interesse para centros de pesquisa, assim como para a indústria farmacêutica futuramente.
Recentemente fomos contemplados com o auxílio concedido pela FAPESP, possibilitando dar continuidade aos ensaios propostos no atual projeto, abrangendo também o desenvolvimento dos demais projetos paralalelos a nossa linha de pesquisa. Assim estamos aguardando a chegada dos materiais de importação junto à FAPESP, para darmos continuidade aos objetivos propostos neste projeto.
Paralelo a essas atividades, no momento estou co-orientando um aluno de mestrado (Lucas Pires Garcia Oliveira), auxiliando-o no desenvolvimento das técnicas e protocolos que serão adotados em seu projeto intitulado: Ação imunotoxicológica/imunomoduladora da geoprópolis associada à doxorrubicina sobre monócitos humanos. Este projeto tem com base os dados anteriores de nosso grupo, visando elucidar a possível ação imunotoxicológica e imunomoduladora da geoprópolis em combinação com doxorrubicina sobre células de indivíduos saudáveis. Diante das condições dos tratamentos quimioterápicos existentes, seus efeitos colaterais, o impacto no sistema imunológico e infecções associadas, aventamos em analisar a utlização da geoprópolis associada à doxorrubicina avaliando a expressão de marcadores celulares, produção de citocinas e de peróxido de hidrogênio, e a atividade microbicida de monócitos humanos. Este trabalho tem como implicação prática a adoção da combinação na terapêutica futuramente, o que pode vir a ser relevante, diminuindo a concentração do quimioterápico e efeitos colaterais, sem afetar as funções imunológicas.
É importante ressaltar ainda, que no decorrer do meu pós-doutoramento fui contemplado por uma bolsa de pós-doutorado pela FAPESP, com vigência de 01/03/2016 a 28/02/2018. Com base no exposto venho solicitar a prorrogação do meu estágio até 28/02/2018.
Assim, sendo só o que se apresenta, agradeço à PROPe pelo pós-doutoramento concedido e pela atenção dispensada, neste momento, renovo os protestos de elevada consideração com a Pró-Reitoria de Pesquisa no âmbito da Universidade Estadual Paulista - UNESP.
19 4. Avaliação do supervisor
O pós-doutorando demonstrou cuidado para com a elaboração do presente relatório, e a parte prática foi realizada com esmero e critério, visando sempre resolver problemas metodológicos que se apresentaram durante o desenvolvimento dos experimentos. O estagiário foi cauteloso ao padronizar os experimentos, tendo avançado nos objetivos propostos, motivo pelo qual manifesto-me positivamente quanto à apreciação do relatório. Alguns dados obtidos recentemente ainda estão sendo analisados e o pós-doutorando tem participado da padronização de todas as metodologias que utilizará futuramente em seu projeto de pós-doutorado.
Ademais, o pós-doutorando dedica-se integralmente ao estágio de pós-doutorado participando da rotina laboratorial, demonstrando boa interação ao grupo de pesquisa. O estagiário participa de eventos nacionais e internacionais, além de colaborar com outros projetos do nosso grupo. No período do seu estágio participou da elaboração de um livro e artigos científicos. Pelo exposto, o desempenho do pós-doutorando foi positivo e contribui com nosso grupo.
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