À Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS) e ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia (PPGBiotec) pelo apoio acadêmico. Os produtos foram analisados por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas, para verificar a conversão do substrato em álcool; o excesso enantiomérico foi obtido em cromatógrafo gasoso equipado com coluna quiral, conseguindo separação dos isômeros de acetofenona com excesso enantiomérico de até 100% para a cepa bacteriana I68. Conclui-se que os microrganismos testados geralmente apresentaram boa capacidade de redução de acetofenona em experimentos de biotransformação, fornecendo fontes de compostos enantiomericamente puros.
REDUÇÃO VIA QUÍMICA DO SUBSTRATO REAGENTE
REDUÇÃO DA ACETOFENONA POR DAUCUS CAROTA L
PROCEDIMENTOS GERAIS PARA AS BIOTRANSFORMAÇÕES 38
REDUÇÃO DA ACETOFENONA POR DAUCUS CAROTA L
O potencial biocatalítico de microrganismos contra substratos orgânicos tem sido amplamente utilizado na química orgânica moderna, especialmente devido ao crescente interesse da indústria química fina (farmacêutica e agroquímica), na estereosseletividade da redução de compostos pró-quirais e como resultado na seu grande potencial para utilização na síntese de compostos enantiomericamente puros (ELIEL; WILEN; MANDER, 1994). Os microrganismos compreendem uma enorme diversidade de espécies e apesar das inúmeras aplicações biológicas relatadas na literatura (NEWMAN; .. LAM, 2007), o potencial biocatalítico dos microrganismos isolados no território nacional é pouco estudado em relação à transformação de compostos não naturais. (PORTO, 2006), deixando campo aberto para pesquisas em estudos de biocatálise voltados para síntese orgânica. Este estudo pretende assim contribuir para evidenciar a importância dos microrganismos nos processos de bioprospecção, bem como em experiências de biotransformação.
BIOCATÁLISE
Atualmente, os medicamentos só podem ser comercializados na forma racêmica se for comprovado que ambos os enantiômeros possuem atividade farmacológica ou que o enantiômero farmacologicamente inativo é inofensivo à saúde (PERLES, 2006). Embora biocatalisadores possam ser utilizados a partir de células inteiras de animais, plantas e microrganismos (PIOVAN, 2007), as enzimas presentes nessas células são catalisadores que podem promover reações químicas. As enzimas são proteínas responsáveis pela química da vida, nada é transformado, produzido ou degradado sem a intervenção destes biopolímeros (PORTO, 2002).
Segundo Lehninger (2000), a maioria das enzimas são proteínas e sua atividade está ligada a um sítio ativo ou ponto de “aprisionamento” de substratos através de forças intermoleculares, o que confere a essas proteínas alta especificidade catalítica para seus substratos. A maioria das enzimas é nomeada adicionando-se o sufixo “ase” ao nome do substrato ou à função química associada à reação que ela catalisa. A Enzyme Commission - CE da União Internacional de Bioquímica (IUB) classifica e divide as enzimas em seis classes de acordo com a reação catalisada (CABRAL, 2003).
Outros, no entanto, requerem componentes químicos adicionais chamados cofatores, que podem ser um íon inorgânico (Fe2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+) ou uma molécula orgânica complexa chamada coenzima. As enzimas álcool desidrogenase são responsáveis pela redução estereosseletiva de compostos carbonílicos e derivados (WONG; WHITESIDES, 1994), resultando na formação de álcoois quirais secundários (FABER, 2004). Nas reações de oxidação-redução ocorre uma transferência reversível de elétrons para a base pirimidina – nicotinamida (PORTO, 2002).
Segundo Staathorf (2002), a principal forma de utilização desses biocatalisadores em processos industriais ainda é como células livres, conforme mostra a Figura 6.
ÁLCOOIS QUIRAIS
Vários métodos químicos foram desenvolvidos para a redução enantiosseletiva de cetonas, como o uso de organoaluminatos, especialmente BINAL-H, organoboranos, complexos de ródio(I) e rutênio(II), especialmente Ru(II)-BINAP (TEMBA, 2003) . . A fluoxetina, medicamento utilizado como antidepressivo, pode ser sintetizada por dois processos (Figura 8), começando com uma etapa de bioconversão catalisada pela levedura S. A L-carnitina, medicamento utilizado para prevenir o infarto do miocárdio, pode ser obtida por duas etapas de reações passo a passo. , sendo o primeiro passo uma biotransformação catalisada por S.
A redução das cetonas aromáticas bem como os valores de tempo, rendimento, excesso enantiomérico e configuração do álcool obtido na redução podem ser observados na Tabela 3 abaixo. Embora células microbianas (como leveduras, bactérias e fungos endofíticos) sejam utilizadas na redução assimétrica de compostos carbonílicos, dois aspectos relacionados com enzimas estão envolvidos na formação do produto. O primeiro aspecto a ser analisado é a presença de uma enzima capaz de catalisar a redução assimétrica de compostos carbonílicos pró-quirais, ou seja, a ação da carbonil redutase.
Outro aspecto é a regeneração do cofator, uma vez que é necessária uma quantidade suficiente de cofator nas células microbianas para que ocorram reações de redução. A atividade biocatalítica da enzima pode ser melhorada biotecnologicamente através do uso de células microbianas recombinantes (BRAUTIGAM; BRINGER-MEYER; WEUSTER-BOTZ, 2007). A tecnologia de DNA recombinante pode ajudar a superar limitações como a adição de genes que codificam a enzima carbonil redutase e a regeneração do cofator, de modo que esses microrganismos recombinantes possam ser usados como biocatalisadores na redução assimétrica de compostos carbonílicos.
A clonagem e a superexpressão do gene que codifica a enzima de interesse, por exemplo, em células recombinantes de Eschericha coli, podem ser utilizadas para implementar ainda um sistema de regeneração de cofatores intracelulares adequado, alcançando uma melhoria na atividade biocatalítica (KATAOKA, 1999).
SUBSTRATO
MICRORGANISMOS
As colônias bacterianas foram isoladas, caracterizadas e identificadas por Rocha, G. 2007), sendo rizobactérias, bactérias do solo que possuem relação associativa e simbiótica com amendoim forrageiro (Arachis pintoi Krapov.. amp; W. C. Gregory), coletadas na região Sul do estado. Bahia na Estação Zootécnica do extremo sul da CEPLAC em Itabela, e nas fazendas Ubirajara e São Francisco em Belmonte, localizadas na região sul da Bahia (Tabela 6). Os fungos utilizados neste estudo foram isolados de ramos laterais da copa de seringueiras (Hevea brasiliensis) por Rocha, A. 2007), pertencentes a diferentes cultivares (Tabela 7), no município de Igrapiúna, região sudoeste da Bahia. ...
REATIVAÇÃO E CULTIVO DOS MICRORGANISMOS
REDUÇÃO VIA QUÍMICA DO SUBSTRATO REAGENTE: ACETOFENONA
REDUÇÃO DA ACETOFENONA POR DAUCUS CAROTA L. (CENOURA)
PROCEDIMENTOS GERAIS PARA AS BIOTRANSFORMAÇÕES
O meio de cultura contendo os microrganismos foi separado por meio de filtração a vácuo e o produto foi extraído com solvente orgânico (acetato de etila) através de funil de separação. As extrações foram repetidas em três porções de acetato de etila, a fase orgânica foi seca com sulfato de magnésio anidro. A fase orgânica da separação foi analisada em um cromatógrafo gasoso Shimadzu CG-2010 conectado ao espectrômetro de massa Shimadzu CGMS-QP2010 equipado com uma coluna capilar CP-Sil-5CB-MS, sílica fundida WCOT, 30 m x 0,25 mm ID x 0. 25 µm, marca Varian.
O excesso enantiomérico foi determinado analisando a fase orgânica em cromatógrafo gasoso Modelo: Varian CP-3380 com detector de ionização de chama (DIC) equipado com coluna quiral de separação de fases Modelo: 25m x 0,22mm SGE com 0,25mm e programação: Ti= 100ºC , r = 5ºC/min, tf=170ºC deixado por 25 minutos.
REDUÇÃO VIA QUÍMICA DO SUBSTRATO ACETOFENONA
REDUÇÃO DA ACETOFENONA POR DAUCUS CAROTA L. (CENOURA)
LEVEDURAS
Quanto à enantiosseletividade das transformações pode-se observar que em uma reação de 7 dias com levedura a acetofenona produziu 1-feniletanol de configuração S com excesso enantiomérico entre 61 e 88% com exceção da reação com a cepa E4 para o qual o ee foi de 45%. Quando foram utilizadas as cepas E2, E3 e E5, o percentual ee foi reduzido, dando valores de 62 e 57%, respectivamente. Os resultados (visualizados na Tabela 8 e Figura 22) indicam que cepas de Saccharomyces cerevisiae isoladas em cachaçarias baianas continham a enzima álcool desidrogenase e foram capazes de reduzir a acetofenona ao álcool de configuração S 1-feniletanol, embora com baixas taxas de conversão. as cepas P35 e E1 foram as mais promissoras para aplicação, pois poderiam levar aos maiores excessos enantioméricos.
Um dos fatores que pode ter influenciado no baixo rendimento de conversão da acetofenona em álcool quiral pode estar relacionado à baixa solubilidade do substrato orgânico em água, embora a acetofenona seja líquida à temperatura ambiente, limitando assim sua disponibilidade para a ação de microrganismos. aumenta (VIERA, 2006). Como as reações em biocatálise normalmente são realizadas em meio aquoso, esta poderia ser uma alternativa segundo Andrade, Piovan e Pasquini (2009). A alternativa estudada pelos pesquisadores foi a utilização do glicerol, subproduto da produção do biodiesel, que melhorou o desempenho enzimático do microrganismo estudado, melhorando a conversão (até > 99%) e a enantiosseletividade (até > 99%). . em comparação com reações em solução aquosa ou outros modelos aquosos-orgânicos (THF, éter etílico, tolueno, DMSO e acetonitrila).
Grupos substituintes retiradores de elétrons localizados em para no anel aromático da acetofenona aumentam a velocidade da reação de redução mediada pela levedura de panificação (BRENELLI et al., 1992). Rodrigues e Moran (2001) afirmam que os grupos retiradores de elétrons posicionados tanto no anel quanto na parte alifática das acetofenonas melhoram ligeiramente o rendimento e provocam um aumento significativo no ee, atingindo valores acima de 90%.
BACTÉRIAS
A transformação química foi verificada por cromatografia gasosa e calculada com base na relação entre as áreas dos picos de acetofenona e 1-feniletanol nos cromatogramas obtidos (Figura 25). Os resultados são apresentados na Tabela 9. Das bactérias testadas, a I116 (gênero Ochrobactrum) foi o microrganismo que melhor reduziu o substrato acetofenona, conversão média de 72 e 79% para as porções tomadas no sétimo e décimo quarto dias respectivamente. Para confirmar o enantiômero produzido, foi então realizada co-injeção de 2 µl de solução contendo 40 µl da amostra de biorredução de I68 e 20 µl da amostra de álcool racêmico obtida na síntese química com borohidreto de sódio.
A partir da co-injeção obteve-se um cromatograma (Figura 27), indicando que o álcool formado era de configuração S devido ao aumento da área do pico correspondente ao álcool S na mistura racêmica. Porém, Lima e Angnes (1999) enfatizam que embora algumas enzimas presentes em microrganismos sejam capazes de catalisar reações em meio aquoso, isso apresenta limitações relacionadas à estabilidade enzimática e à fraca solubilidade de alguns substratos. S)-1-feniletanol (R)-1-feniletanol. no meio de cultura YPD) e o uso exclusivo de água como solvente pode limitar uma série de aplicações de biocatálise (AIRES-BARROS, 2002).
FUNGOS
Quanto à formação de enantiômeros, os microrganismos CDC086 e CDC026 e MDF077 produziram álcool quiral com 56, 54 e 84% ee, a análise dos cromatogramas, Figura 30, mostra que o álcool quiral produzido tem configuração anti-prelog R (Tabela 10). . As cepas FX127 e MDF092 produziram o álcool quiral com excesso enantiomérico de 71 e 41%, respectivamente; a análise de seus cromatogramas mostra que o álcool de configuração S foi o principal produto da biocatálise. Comasseto e colegas (2004) estudaram as biotransformações realizadas pelas células dos fungos Aspergillus terreus CCT 4083, A. terreus CCT 3320 e Rhizopus oryzae CCT 4964 em direção ao substrato acetofenona e outras acetofenonas substituídas.
Em relação ao substrato acetofenona, os álcoois obtidos nas biotransformações foram sempre de configuração S. Porém, com a mudança de substrato, ocorreu um produto alcoólico com configuração R. 2009) demonstraram que fungos endofíticos associados a T. Apesar disso, porém, os fungos endofíticos constituem uma fonte praticamente inexplorada em estudos de biotransformação, uma vez que existem poucos relatos na literatura sobre a aplicação desses microrganismos como biocatalisadores (BORGES et al., 2009). Todas as cepas de Saccharomyces cerevisiae utilizadas foram capazes de converter o substrato acetofenona em (S)-1-feniletanol com taxas de conversão entre 6 e 29% e excessos enantioméricos de 45 a 89%.
Enhancement of the enantioselective bioreduction of aromatic ketones mediated by Aspergillus terreus and Rhizopus oryzae: the role of glycerol as a co-solvent. Deracemization of aryl ethanols and reduction of acetophenones by whole fungal cells of Aspergillus terreus CCT 4083, A. Stereoselective reduction of ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate by Escherichia coli transformant cells co-expressing the aldehyde reductase and glucose dehydrogenase.
Candida viswanathii as a novel biocatalyst for the stereoselective reduction of heteroarylmethyl ketones: a highly efficient enantioselective synthesis of (S)-α-(3-pyridyl)ethanol.
