Nesse contexto, Gomes et al. 2003), que estudou o papel da resposta imune no desenvolvimento da patologia na doença de Chagas humana, observou que pacientes com a forma cardíaca secretavam altos níveis de IFN-. A partir desses resultados, os autores sugerem que a perda de células miocárdicas por apoptose e fibrose contribui para o desenvolvimento de insuficiência cardíaca na fase crônica da doença de Chagas (Tostes et al., 2005).
OBJETIVO GERAL
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Locais de realização
Caracterização da população estudada
Critérios de inclusão
O diagnóstico sorológico da doença de Chagas é caracterizado pela presença de pelo menos duas reações sorológicas positivas entre as três técnicas utilizadas ELISA, IFI e HAI;. A presença de alterações eletrocardiográficas compatíveis com conexão de bloqueio completo de ramo direito e hemibloqueio anterior esquerdo;
Critérios de exclusão
Níveis pressóricos dentro da normalidade (sistólica < 160 mmHg e diastólica < 90 mmHg); Consentimento voluntário em participar da pesquisa b.1) história de hipertensão arterial sistêmica, ou; .. b.3) provável sobrecarga ventricular esquerda no ECG segundo critério de Romhilt-Estes, ou; .. b.4) evidência de dilatação aórtica na radiografia de tórax.;.
Grupos de estudo
Coleta do sangue periférico
Contagem de Leucócitos
Obtenção do antígeno solúvel da forma epimastigota de T. cruzi (EPI)
Detecção de apoptose no sangue periférico de indivíduos não infectados e
Detecção de apoptose através da marcação por Anexina-V conjugada ao 7AAD
A coloração por 7AAD é baseada na diferença na permeabilidade da membrana de células vivas, apoptóticas e mortas ao corante marcador de DNA. Células com membranas intactas excluem 7AAD, enquanto membranas de células danificadas e mortas são permeáveis a 7AAD.
Detecção de apoptose através da marcação por Caspase-3 ativa
Após a incubação, 2 ml de PBS-W gelado (PBS contendo 0,5% de albumina de soro bovino) foi adicionado e, em seguida, os tubos de cultura foram centrifugados (Beckman Centrifuge Modelo J-6B, EUA) a 1300 rpm por 7 minutos em sala. a temperatura. Após esse tempo, as células foram lavadas duas vezes com PBS-W gelado (PBS contendo 0,5% de albumina de soro bovino) e os tubos foram centrifugados (Beckman Centrifuge Modelo J-6B, EUA) a 1300 rpm, por 7 minutos, à temperatura ambiente. temperatura. .
Obtenção de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs)
Ensaio de proliferação celular
O papel de fibra de vidro contendo as células radioativas foi seco em estufa e colocado em frascos de cintilação líquida aos quais foram adicionados 3,5 mL do coquetel de cintilação, contendo em cada litro de tolueno: -333 mL Triton X 100 (Sigma) , - 5g PPO ( 2,5-difeniloxazol / Fisher Scientific Company, N.J., EUA) - 0,1g POPOP (1,4-bis 2-[5-feniloxazolil]-benzeno] / Fisher).
Análise de marcadores de superfície e citocina intracitoplasmática (TNF-α) em
Posteriormente, as amostras foram lisadas e fixadas em 2 ml de solução comercial de lise (Facs Lysing Solution - FLS - BD, USA) por 10 minutos em temperatura ambiente protegida da luz. Para detecção intracitoplasmática de citocinas, 2,5 ml de PBS-P (PBS, pH 7,4, contendo 0,5% BSA, 0,1% azida de sódio e 0,5% saponina) foram adicionados aos tubos por 10 minutos em temperatura ambiente, seguido pela adição de 20 µL de anticorpos, anti-TNF-α (PE) (L293)–(BD Pharmingem), diluídos 1:50 em PBS-P nos respectivos tubos e então incubados por 30 min em temperatura ambiente, protegidos da luz.
Detecção do nível de citocinas plasmáticas
O BD CBA Analysis Software seleciona automaticamente a área de captura das esferas em parcelas de tamanho com base na fragmentação (Figura 1A). Inicialmente, o programa solicita a seleção automática da população de esferas de captura em parcelas de tamanho por fragmentação (Figura 1A).
Obtenção e análise dos dados no citômetro de fluxo
As Figuras 3A e 3C mostram o perfil celular característico dos gráficos de fluorescência 1 – FL-1 (CD4 e CD8 FITC) versus granularidade (SSC), onde as subpopulações de linfócitos T CD4 e CD8 foram selecionadas através de regiões marcadas (R3, R4, respectivamente). A Figura 4C mostra o perfil celular obtido em parcelas de tamanho (FSC) versus fluorescência 2 - FL-2 (caspase 3 - PE).
Análise Estatística
A primeira parte consiste em experimentos para detecção de apoptose em populações e subpopulações de células sanguíneas periféricas de indivíduos dos grupos NI, IND e CARD. Na segunda parte, o objetivo foi investigar o panorama fenotípico de linfócitos T no sangue periférico de indivíduos dos grupos NI, IND e CARD submetidos à estimulação in vitro por EPI. Assim, o antígeno EPI foi responsável por estimular as células de memória dos indivíduos dos grupos IND e CARD.
A quarta parte deste projeto teve como objetivo avaliar a resposta proliferativa de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de indivíduos dos grupos NI, IND e CARD após estimulação in vitro com EPI.
Detecção de apoptose no sangue periférico de indivíduos dos grupos NI, IND e
Análise do percentual de linfócitos totais anexina +
Ainda nas culturas estimuladas por 24 horas com STP houve aumento significativo na porcentagem de linfócitos anexina+ totais dos indivíduos do grupo NI em relação à cultura controle (p=0,004) e mesmo à cultura estimulada por EPI (p=0,012 ), que já diferia estatisticamente da cultura de controle (Figura 9B). Além disso, ao analisar os linfócitos anexina+ totais, houve um aumento significativo na porcentagem dessas células no grupo CARD em relação aos grupos NI (p=0,032) e IND (p=0,006) (Figura 9A). Após estimulação específica por EPI, observou-se aumento no percentual de linfócitos anexina+ totais no grupo IND (p=0,003), em relação ao grupo NI (Figura 9B).
68 Avaliando o estímulo inespecífico do STP, em 24 horas entre os grupos, houve um aumento significativo no número total de linfócitos anexina+ no grupo CARD em relação aos grupos NI (p=0,024) e IND (p=0,003) (Figura 9B ) ).
Análise do percentual de linfócitos T CD4 + anexina +
Resultados semelhantes foram observados após estimulação com STP, sem diferenças significativas na porcentagem dessas células nos grupos estudados, em relação às suas culturas controle. Pela avaliação comparativa entre os grupos, já foi possível observar um aumento significativo na porcentagem dessas células nas culturas controle dos grupos IND (p=0,016) e CARD (p=0,000), em relação ao grupo NI . (Figura 11). Após o estímulo específico por EPI, também foi observado aumento significativo de linfócitos T CD4+anexina+ nos grupos IND (p=0,039) e CARD (p=0,005), em relação ao grupo NI.
Avaliando o estímulo por STP, houve aumento significativo dessas células nos grupos IND (p=0,023) e CARD (p=0,003), em relação ao grupo NI.
Análise do percentual de linfócitos T CD8 + anexina +
71 Na avaliação comparativa entre estímulos dentro do mesmo grupo, observou-se que não houve diferenças significativas na porcentagem de linfócitos T CD4+anexina+ após estimulação com EPI, em comparação com as culturas controle dos grupos NI, IND e KORT ( Figura 11 ). No grupo CARD também houve aumento significativo na porcentagem dessas células em relação aos grupos NI (p=0,000) e IND (p=0,014) (Figura 12). Avaliando o estímulo inespecífico do STP, houve aumento significativo na porcentagem de linfócitos T CD8+anexina+ nos grupos IND (p=0,000) e CARD (0,000) em relação ao grupo NI.
Ainda no cultivo estimulado com STP, observou-se aumento significativo na porcentagem dessas células no grupo CARD em relação aos grupos NI (p=0,000) e IND (p=0,002) (Figura 12).
Detecção de apoptose no sangue periférico de indivíduos dos grupos NI, IND e
Análise do percentual de linfócitos totais caspase 3 +
Houve também aumento significativo na porcentagem de linfócitos caspase 3+ totais nos grupos IND (p=0,021) e CARD (p=0,039) estimulados por STP, em comparação com culturas estimuladas por EPI. Da mesma forma, houve aumento significativo na porcentagem de linfócitos caspase 3+ totais nos indivíduos dos grupos NI (p=0,004), IND (p=0,000) e CARD (p=0,000), após 24 horas de estimulação pelo EPI , em comparação com suas culturas de controle (Figura 13B). O efeito da estimulação antigênica inespecífica por STP também mostrou um aumento significativo na porcentagem de linfócitos totais caspase 3+ nos grupos NI (p=0,001), IND (p=0,000) e CARD (p=0,000), em comparação com seus culturas de controle (Figura 15B).
Em relação à avaliação comparativa do percentual de linfócitos caspase 3+ total entre os indivíduos dos grupos NI, IND e CARD em 24 horas (Figura 13B), observou-se aumento significativo nos grupos IND (p=0,022) e CARD. indivíduos (p=0,010), após estimulação por EPI, em comparação com culturas não estimuladas.
Análise do percentual de linfócitos T CD4 + caspase 3 +
77 Na avaliação comparativa, entre os estímulos dentro do mesmo grupo após a estimulação do STP, a análise dos dados mostrou que houve um aumento significativo na porcentagem de linfócitos T CD4+caspase 3+ ao comparar as duas culturas de controle (p=0,000), para as culturas estimuladas por EPI (p=0,000) do grupo NI. Ao avaliar a estimulação específica pelo EPI, houve um aumento significativo na porcentagem de linfócitos T CD4+caspase 3+ nos grupos IND e CARD, em relação às suas culturas não estimuladas (p=0,021 ep=0,021 ep=0,021 , respectivamente). =0,034). Resultados semelhantes foram observados nos grupos IND e CARD em culturas estimuladas por STP com aumento significativo (p=0,000 ep=0,010, respectivamente) na porcentagem de linfócitos T CD4+caspase 3+ (Figura 15).
Em relação à avaliação comparativa entre os indivíduos dos grupos NI, IND e CARD, não foram observadas diferenças significativas na porcentagem de linfócitos T CD4+caspase 3+ (Figura 15).
Análise do percentual de linfócitos T CD8 + caspase 3 +
Os linfócitos foram avaliados sem estímulo - cultura controle (C) e após estimulação in vitro com EPI e STP em 24 horas. As letras representam diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre os grupos NI x IND x CARD. a) Quando a diferença for relativa ao grupo NI (b) Quando a diferença for relativa ao grupo IND.
Análise do percentual de expressão da molécula CD25 em subpopulações de
Os linfócitos foram avaliados sem estimulação - culturas controle (C) e após estimulação in vitro com EPI por 24 horas de cultura. 81 Na avaliação comparativa, entre estímulos dentro do mesmo grupo, a análise dos dados mostrou que houve aumento estatisticamente significativo (p=0,000) no percentual de linfócitos T CD4+CD25high, após estimulação com EPI apenas no grupo IND em comparação com .seu controle cultural (Figura 18). É interessante notar que através da avaliação comparativa dos resultados entre os grupos NI, IND e CARD, após estimulação por EPI, foi observado um aumento significativo na porcentagem de linfócitos T CD4+CD25-high no grupo IND em comparação com o grupo NI (p=0,010) (Figura 18).
Na Figura 18, após estimulação com EPI, observa-se uma diminuição significativa na porcentagem de linfócitos T CD4+CD25-high no grupo CARD em comparação com o grupo IND (p=0,007).
Análise do percentual de expressão da molécula CD25 na superfície dos linfócitos
Análise do percentual de expressão da molécula CD28 em subpopulações de
Análise do percentual de expressão da molécula CD62L em subpopulações de
Análise do percentual de expressão de linfócitos T CD4 + CD62L -
Análise do percentual de expressão de linfócitos T CD8 + CD62L -
As letras representam diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre os grupos NI x IND x CARD. a) Quando houver alteração em relação ao grupo NI.
Análise do percentual de expressão da molécula CD69 em subpopulações de
É interessante observar que na avaliação comparativa entre os grupos NI, IND e CARD, após estimulação pelo EPI, observou-se aumento significativo na porcentagem de linfócitos TNF-α+ totais nos grupos IND (p=0,000 ) e CARD . (p=0,000) grupos, em relação ao grupo NI (Figura 26). Em relação às subpopulações de células T, a análise dos dados mostrou um aumento na porcentagem de linfócitos T CD4+ TNF-α+ nos grupos IND e CARD (p=0,000, p=0,000 respectivamente), após estimulação por EPI em comparação com o grupo NI (Figura 27). Houve um aumento significativo na porcentagem de linfócitos T CD4+ TNF-α+ na cultura controle do grupo CARD em comparação com as culturas não estimuladas dos grupos NI (p=0,000) e IND (p=0,036) (Figura 27 ).
A análise dos dados mostrou um aumento significativo na porcentagem de linfócitos T CD8+TNF-α+ tanto no grupo IND (p=0,001) quanto no grupo CARD (p=0,006), após estimulação por EPI, em comparação ao grupo NI .
Avaliação do padrão de citocinas plasmáticas em indivíduos dos grupos NI, IND e
As letras representam diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre os grupos NI x IND x CARD. b) Quando a diferença for de acordo com o grupo IND. As letras representam diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre os grupos NI x IND x CARD. a) Quando a diferença é de acordo com o grupo NI (c) Quando a diferença é de acordo com o grupo CARD.
Ensaio de proliferação de PBMCs dos indivíduos dos grupos NI, IND e CARD
Resumo dos Resultados
Em um estudo recente, Rodrigues et al. 2008) também avaliaram a resposta imune de pacientes na fase crônica da doença de Chagas. 18-Araújo FF, Gomes JAS, Rocha MOC, Williams-Blangero S, Pinheiro VM, et al., 2007) Papel potencial das células T altamente regulatórias CD4+CD25 na morbidade da doença de Chagas. Vago AR, Macedo AM, Oliveira RP, et al. 1996) Assinaturas de DNA de cepas de Trypanosoma cruzi obtidas diretamente de tecidos infectados.
Souza PE, Rocha MO, Menezes CA, Coelho JS, Chaves AC, et al. 2007) Trypanosoma cruzi infection induces differential modulation of costimulatory molecules and cytokines by monocytes and T cells from patients with indeterminate and cardiac Chagas disease. Patients with chronic Chagas disease cardiomyopathy exhibit an enhanced IFN-gamma response to Trypanosoma cruzi infection. Nitric oxide-induced apoptotic cell death in the acute phase of Trypanosoma cruzi infection in mice.
