Of the total number of cases reported, 186 died, of which 104 remained under investigation, 79 deaths were confirmed and 3 were discarded. The robustness of the phylogenetic method was through Bootstrap 2000 replicates using the best JTT + G model, Maximum Likelihood.
Flaviviridae: Gênero Flavivírus
O período de incubação externa não se aplica a vírus transmitidos por carrapatos (OMS, 1985; GUBLER et al., 2007). No estudo realizado por Gubber et al. 2007) foi relatado que as Flaviviras transmitidas por mosquitos evoluíram para dois grupos principais que diferiam na apresentação clínica em humanos e na ecologia.
Genoma dos Flavivírus
O genoma do Flavivírus consiste em um RNA de fita simples de polaridade positiva com uma média de 11.000 nucleotídeos (nt); Possui cap tipo I (m7GppAmpN2) na extremidade 5' e metilação do resíduo N2 (cap tipo II) e cauda poliadenilada na extremidade 3', que é perdida durante a replicação quando o RNA viral funciona como RNA mensageiro (mRNA ). ) (ICTV, 2005; LINDENBACH et al., 2007). Sua composição contém uma única região de leitura aberta, do English Open Reading Frame (ORF), que é flanqueada por duas RNCs, 5'RNC e 3'RNC, possuindo aproximadamente 100 nucleotídeos (nt) e 350 a 700 nt, respectivamente. De acordo com um estudo conduzido por Markoff, (2003) as RNCs no RNA genômico do Flavivirus podem estar envolvidas no início da síntese de RNA de sentido negativo e em muitos processos podem estar associadas à mudança na síntese de sentido. ARN.
Em geral, o 5'RNC dos flavivírus transmitidos por mosquitos é menor comparado ao 5'RNC dos flavivírus transmitidos por carrapatos (MARKOFF, 2003). A análise genômica de Flavivírus mostrou que os pares de dinucleotídeos complementares nas extremidades do RNA viral (5'-AG/UC-3') são altamente conservados entre Flavivírus transmitidos por mosquitos e carrapatos, mas não entre alguns Flavivírus transmitidos por insetos. Flavivírus. Além de participar da formação da ciclização do RNA viral, a sequência 5'-ACACA também pode atuar como sítio de reconhecimento para a polimerase viral que pode ser utilizada durante a síntese de RNA de sentido positivo ou negativo (RICE et al., 1985) . .
Estrutura dos Flavivírus
Proteínas estruturais
A ligação ao RNA e a interação com a superfície da membrana baseiam-se numa distribuição assimétrica de resíduos carregados positivamente e resíduos hidrofóbicos. No entanto, não foi elucidado como os dímeros da proteína C são organizados em nucleocapsídeos, mas a interação com RNA ou DNA pode induzir dímeros isolados de proteína C a se reunirem em partículas semelhantes a nucleocapsídeos (LINDENBACH et al., 2007). Conforme mencionado por Lindenbach et al (2007), o precursor da glicoproteína da proteína M, prM, possui aprox. 26 quilodaldons e é translocado para o retículo endoplasmático pelo domínio hidrofóbico C-terminal da proteína estrutural C.
No entanto, a clivagem da peptidase sinal é retardada até que a serina protease viral clive a montante desta sequência para gerar a forma madura da proteína C. A forma nativa da proteína E dobra-se numa estrutura alongada rica em folhas β e forma homodímeros. são paralelos ao envelope do vírus. Cada subunidade da proteína E consiste em três domínios: I, que forma um barril β; II, que se projeta ao longo da superfície do vírus entre as regiões transmembranares das subunidades homodiméricas; e III, que retém uma dobra semelhante à imunoglobulina.O domínio III parece estar envolvido na ligação ao receptor e é um dos principais alvos dos anticorpos neutralizantes (ZHANG W et al., 2003).
Proteínas não estruturais
Conforme mencionado em diversos estudos, o enovelamento adequado, a estabilização em pH baixo e a secreção de E dependem da coexpressão com prM (LORENZ IC et al., 2002). Estudos indicam que a atividade do cofator está em um peptídeo central que se intercala dentro da dobra do domínio da serina protease (ERBEL P et al., 2006). A proteína não estrutural NS3 é uma proteína multifuncional e grande em relação a outras proteínas não estruturais, com massa de cerca de 70 quilodaltons, contendo diversas atividades necessárias para o processamento de poliproteínas e replicação de RNA.
Logo foi notado que o domínio N-terminal subsequentemente purificado do DENV-2 NS5 poderia transferir grupos metil do SAM para substratos de RNA (EGLOFF MP et al., 2002). Estudos abordaram a atividade polimerase da NS5, o que foi confirmado pelo desenvolvimento e aplicação da NS5 recombinante em estudos bioquímicos (ACKERMANN. & PADMANABHAN, 2001; GUYATT et al., 2001). A NS5, especialmente na sua forma fosforilada, é encontrada no núcleo das células infectadas e pode estar envolvida na ativação e secreção de mediadores químicos, como a interleucina-8 (IL-8), uma citocina envolvida no recrutamento e sinalização celular. processos para o local da infecção, levando ao agravamento da infecção pelo vírus (LINDENBACH et al., 2005).
Replicação dos Flavivírus
A fase final da maturação viral envolve o processamento de PrM e proteína C, bem como a glicosilação das proteínas E e PrM num mecanismo semelhante à glicosilação de proteínas celulares.
Filogenia
Portanto, deve-se notar que muitos Flavivírus são continuamente transferidos entre vertebrados e artrópodes e podem se readaptar a cada passagem durante as alternâncias de hospedeiros (LIN et al., 2004). O estudo da filogenia dos Flavivírus sugere o surgimento de pequenas peculiaridades na compreensão do padrão de distribuição desses vírus pelo mundo. Hipotetizando que os Flavivírus transmitidos por mosquitos se originaram de vírus de carrapatos, foi proposto que os Flavivírus surgiram na África e, além disso, que todos os Flavivírus transmitidos por carrapatos e mosquitos divergiram de um ancestral comum originário do Velho Mundo (GUBLER et al., 2007). .
A filogenia dos flavivírus transmitidos por mosquitos apresenta uma descontinuidade no padrão evolutivo com menor confinamento geográfico e frequente extinção de linhagens (COOK & HOLMES, 2006; GOULD et al., 2003b; ZANOTTO et al., 1996). Como consequência, os seres humanos têm sido expostos a uma diversidade crescente de estirpes de Flavivírus transmitidas por mosquitos.
Febre amarela
- Vírus da Febre Amarela (VFA)
- Patogênese da Febre Amarela
- Diagnóstico para Febre Amarela
- Febre Amarela no Brasil
Porém, o rim, o baço, os gânglios linfáticos e o coração, e provavelmente outros tecidos, também são infectados pelo vírus da febre amarela (MONATH e VASCONCELOS, 2014). Isto reflecte a origem do vírus da febre amarela em África há vários milhares de anos e uma co-evolução equilibrada de vírus e hospedeiros (MORENO et al., 2013). O diagnóstico sorológico, por outro lado, permite a detecção de anticorpos específicos e é útil para diagnosticar a febre amarela durante a fase pós-virêmica da doença (ou seja, a partir do quinto dia após o início dos sintomas).
Desde então, o controle da febre amarela tem sido conduzido através da observação de primatas não humanos como monitores da atividade de arbovírus. Série histórica do número de casos confirmados de febre amarela silvestre humana e mortalidade no Brasil de 1980 a 2016. A febre amarela é uma doença infecciosa não infecciosa causada pelo vírus da febre amarela (VFA), um flavivírus pertencente ao sorogrupo A da família Flaviviridae . família
Objetivo Geral
Desde o final de 2016, uma grave epidemia de AGV foi relatada no sudeste do Brasil, resultando em 79 mortes confirmadas em laboratório. Em 2017, foram notificados 1.170 casos suspeitos de FA, do total de casos notificados, 186 resultaram em óbito, 104 óbitos ainda estão em investigação, 79 óbitos foram confirmados e 3 foram descartados (BRASIL, 2017).
Objetivos Específicos
Delineamento do estudo e aspectos éticos
Local de estudo
Seleção das amostras e realização dos testes moleculares
Amostra
Procedimento
- Extração do RNA viral
- Transcrição Reversa – RT
- Reação em Cadeia pela Polimerase – PCR
- Uniplex-Nested-PCR
- Sequenciamento nucleotídico
- Similaridade das Sequências obtidas
Os tubos foram levados ao Termociclador automático (Amplitherm) e submetidos à incubação por uma hora a 50ºC, seguida de incubação por quinze minutos a 70ºC. Ao final da reação, a temperatura foi reduzida para 4ºC e os tubos foram então retirados para a próxima etapa da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Os tubos foram levados ao Termociclador automático (Amplitherm) e submetidos aos seguintes ciclos, com o objetivo de amplificar o material genético: 30 ciclos de 94 °C / 1 minuto, 53 °C / 1 minuto, 72 °C / 2 minutos. minutos e temperatura final das extensões de 72°C/5 minutos.
Ao final da reação, a temperatura foi reduzida para 4ºC e os tubos foram utilizados para prosseguir para a próxima etapa do Uniplex-Nested PCR. Os tubos foram então enviados para o Termociclador (Amplitherm) e a reação foi ciclada nas seguintes condições: 30 ciclos de 94°C/1 minuto, 53°C/1 minuto, 72°C/2 minutos e extensão final a 72°C. C/5 minutos. Ao final da reação, a temperatura foi reduzida para 4ºC e o produto foi visualizado em gel de agarose através de eletroforese.
Análise Filogenética
A comparação do tamanho do amplicon foi realizada usando um marcador DNA Ladder RTU de 100 pb modelo k9-100L e o controle da vacina contra febre amarela. A corrida eletroforética foi realizada a 80 V e os resultados foram observados através do transiluminador UVTrans, com imagem registrada no fotodocumento anexo. Para a etapa de sequenciamento genético de nucleotídeos dos amplicons de amostras positivas, eles foram purificados a partir de gel de agarose utilizando o QIAquik Gel Extraction Kit (QIAGEN, Alemanha) no qual o eluato purificado e confirmado foi obtido em um volume de 1 L. corrida eletroforética.
As sequências obtidas de cada primer foram concatenadas para produzir a sequência consenso utilizando o software Geneious v. Esta sequência foi submetida ao site do NCBi (www.ncbi.nlm.nih.gov) para identificação e similaridade utilizando o software BLAST, que confirmou a porcentagem de identidade com os vírus da febre amarela. A análise dos dados incluiu a confirmação da presença do amplicon do vírus da Febre Amarela onde os padrões de peso molecular dos amplicons formados no gel de agarose contendo 253 pb foram comparados com o tamanho esperado e aqueles descritos na literatura por Bronzoni et al. 2004), além da presença do seu controle positivo.
Diagnóstico molecular
Para construir a árvore, primeiro a partir do alinhamento gerado, foi avaliado o melhor modelo de substituição. Após a definição do modelo, a construção das árvores baseia-se na aplicação do modelo selecionado com a implementação de metodologias de máxima verossimilhança associadas a uma pontuação estatística de bootstrap para cada nódulo. Após a geração da árvore fonte, foram aplicadas a hipótese do relógio molecular e o teste de neutralidade de Tajima.
Além disso, a divergência evolutiva média entre todos os pares de sequências e entre sequências foi estimada para determinar o caráter evolutivo mínimo e global associado às sequências.
Confirmação da Identidade das Sequências
Alinhamento realizado com o programa BLASTp mostrando homologia da sequência obtida nas amostras 15 com outros vírus da febre amarela. Alinhamento realizado com programa BLASTp mostrando homologia de sequências obtidas da amostra 18 com outro vírus da febre amarela.
Alinhamento de Sequências
Alinhamento das sequências obtidas no banco de dados Genbank com três amostras de estudo no software MEGA7.
Análise filogenética
- Escolha do melhor modelo de substituição
- Construção da Árvore Filogenética
- Teste de Neutralidade de Tajima
- Estimativas da Divergência Evolutiva Média em Todos os Pares de Sequências
- Estimativas da divergência evolutiva entre sequências
- Teste de relógio molecular
Relações de todas as séries analisadas, bem como a inserção do Outgroup que demonstra maior distanciamento em relação aos demais. A análise pelo teste D de Tajima e pela hipótese do relógio molecular verificou que não houve expansão populacional e mostrou que não houve divergência entre as sequências analisadas. A febre amarela viva atenuada 17D infecta DCs humanas e permite a apresentação de epítopos de células T endógenos e recombinantes.
Out of Africa: A molecular view of yellow fever virus introduction into the Americas. Multigene analysis of phylogenetic relationships among flaviviruses (family: Flaviviridae) and the evolution of vector transmission. Expression and purification of an enzymatically active recombinant RNA-dependent RNA polymerase (NS5) of flavivirus Kunjin.
Fever versus fever: the role of host and vector susceptibility and interspecific competition in shaping the current and future distribution of the sylvatic cycles of dengue virus and yellow fever virus. Genetic analysis of yellow fever virus NS1 protein: Identification of a temperature-sensitive mutation that blocks RNA accumulation.
