7.4 Análise filogenética
7.4.6 Teste de relógio molecular
Foi executado um teste de máxima probabilidade da hipótese do relógio molecular para uma topologia de árvore e alinhamento de sequências. A "Hipótese do Relógio Molecular" significa que todas as dicas da árvore são equidistantes da raiz da árvore. Dois valores de log-verossimilhança são calculados e exibidos, um com e outro sem a hipótese do relógio. O sem hipótese do relógio molecular sempre será maior (observa-se que os números são negativos, então "maior" significa "menor em valor absoluto"). A significância estatística da diferença pode ser testada comparando duas vezes a diferença nos valores de log- verossimilhança com um valor limiar qui-quadrado com s-2 graus de liberdade, onde s é o número de sequências no alinhamento. Os dados são demonstrados na tabela a seguir.
Tabela 4. O teste de relógio molecular foi realizado comparando o valor de MP para a topologia dada com e sem as restrições de relógio molecular sob o modelo de Jones-Taylor-Thornton (1992) (+ G)
lnL Parâmetros (+G)) (+I) Com Relógio -744.850 55 0.672 n/a Sem Relógio -560.315 108 2.10 n/a
As diferenças nas taxas evolutivas entre os sítios foram modeladas usando uma distribuição de Gamma (G) discreta (parâmetro de forma mostrada). A hipótese nula de taxa de evolução igual em toda a árvore foi rejeitada em um nível de significância de 5% (P = 8,496 E-031). A análise envolveu 55 sequências de aminoácidos. Todas as posições que continham lacunas e dados em falta foram eliminadas. Houve um total de 81 posições no conjunto de dados final. Análises evolutivas foram realizadas em MEGA7.
8 DISCUSSÃO
Segundo Vasconcelos (2003), a Febre Amarela (FA) retrata-se como uma doença viral febril ictérica, hemorrágica, infecciosa, não contagiosa, que pode levar a óbito cerca de 20 a 60% dos casos, endêmica em regiões da África e da América do Sul, acometida por um vírus da família Flaviviridae, o Vírus da Febre Amarela (VFA). O diagnóstico dessa patologia baseia-se em testes sorológicos, isolamento viral por métodos moleculares e post-mortem (OMS, 2017).
De acordo com a Sociedade Brasileira de Infectologia - SBI (2017), os primeiros registros da FA no Brasil foram no ano de 1685, quando uma primeira epidemia da doença foi registrada em Recife (PE), tendo sido levada por uma embarcação vinda de São Tomé, na África.
De acordo com o Ministério da Saúde (2017) e SBI (2017) a doença, mesmo tendo em conta, uma vacina considerada de forma geral eficaz, desenvolveram alguns picos endêmicos isolados nos anos de 1984, 1993 nos intervalos entre 1999-2003 e nos anos de 2008 e 2009.
No ano de 2014 evidenciaram nova emergência da doença em alguns estados Brasileiros. No ano de 2017 novos casos ressurgiram em diversos pontos do país, causando óbito confirmado pela doença de aproximadamente 80 pessoas, outros óbitos ainda permanecem em investigação.
O presente estudo analisou amostras obtidas no município de Goiânia – GO coletadas durante o ano de 2013, as quais foram triadas para o Vírus da Dengue por testes sorológicos e RT- PCR, portanto, foram negativas para o mesmo. Dentre o quadro clínico apresentado pelos pacientes destacam-se náuseas, vômitos, diarreia, prostração, mialgia, artralgia e dor abdominal com duração aproximadamente de quatro dias para ambos. Assim sendo, de acordo com a literatura esses sintomas não são específicos para a FA como relatado anteriormente.
Os pacientes tiveram evolução para a cura. Análises hematológicas foram realizadas nos pacientes para que quaisquer outras possíveis causas fossem pesquisadas. Portanto, todos os resultados obtidos nestes foram dentro dos padrões de normalidade.
Existe a possibilidade de ocorrerem reações cruzadas ao se submeter amostras suspeitas para Flavivírus de importância médica por métodos sorológicos de diagnóstico, visto que os anticorpos circulantes após uma infecção por esses agentes podem reagir com outros protótipos da mesma família. Portanto, para que esse problema não ocorresse às amostras obtidas foram submetidas a ensaios moleculares pelo método de RT- PCR, que visa isolar o agente viral confirmando assim a presença do material genético viral presente. Contudo,
pode-se dizer que no ano de 2013, mesmo antes do surto de 2014 e 2017 já existia a circulação do VFA no município de Goiânia, Goiás. Não foi possível avaliar se esses pacientes tiveram contato com outros estados ou cidades, pois os dados fornecidos não possuíam essas especificações.
Os amplicons formados no gel após a padronização da reação de RT-PCR foram condizentes com a aplicabilidade da técnica em questão, visto que foi possível analisar produtos com o tamanho de 253 pb para o VFA, assim sendo, os primers internos selecionados foram eficazes para ampliação do gene como era esperado. A técnica de RT- PCR também foi empregada no trabalho de Poloni (2009), obtendo amplicons com extensão de 253 pb, confirmando a presença do VFA em suas análises.
A posição do gene encontrado e ampliado no presente estudo refere-se a uma região mediana da proteína não estrutural NS5 do VFA. Posição 216 a 296 desta proteína, conferindo 81 aminoácidos, confirmados pelo sequenciamento genético automatizado.
Chambers e colaboradores (1990) citaram que a proteína NS5 possui peso molecular em torno de 103 kDa, sendo assim, a maior proteína entre os Flavivírus, altamente conservada, atua como RNA polimerase RNA dependente e localiza-se no citoplasma. A NS5 também apresenta atividade de metiltransferase envolvida na formação do terminal cap 5’ do RNA viral.
As amostras positivas para o VFA foram alinhadas utilizando o Software MEGA7 para posterior analise filogenética. Como cita Gubler e colaboradores (2007), as análises filogenéticas têm possibilitado melhor compreensão sobre a natureza evolutiva do gênero Flavivírus, bem como colaborado para o entendimento da epidemiologia molecular e dispersão global desses vírus. O alinhamento foi realizado junto às demais porções da proteína não estrutural NS5 do VFA do banco de dados do Genbank. O grupo externo (Outgroup) foi escolhido baseando-se que seja sabidamente distante de todas as outras entidades considerado como possuindo um ancestral comum com todas para o enraizamento na montagem da arvore filogenética, assim sendo, o grupo externo escolhido foi uma cepa do Vírus da Dengue 2 (DENV2) AII99332 permitindo o enraizamento para gerar a árvore.
A construção da árvore filogenética depende da seleção de melhor modelo para analise, onde os modelos com os escores BIC (Bayesian Information Criterion) mais baixos são considerados para descrever o padrão de substituição. Para cada modelo, o valor AICc (Akaike Information Criterion, corrigido), o valor de máxima probabilidade (lnL) e o número de parâmetros (incluindo comprimentos de derivação) também foram apresentados (NEI M E
AL., 2000). Portanto, o modelo de substituição que apresentou menor escore foi o JTT+G, sendo este aplicado para análise.
A árvore gerada foi baseada em sequências aminoacídicas da NS5, tanto as amostras do estudo quanto as sequências obtidas pelo Genbank. Como citado em trabalhos anteriores, árvores filogenéticas baseadas na sequência aminoacídica da proteína NS5 apresentaram resultados similares da análise nucleotídica com relação a subdivisões em grupos, clados e espécies virais (KUNO ET AL., 1998; GUBLER ET AL., 2007).
Foi possível observar o caminho evolutivo das sequências analisadas em relação às demais, bem como sua inserção após a construção da árvore, próximas aos táxons correspondentes do Senegal. Sendo assim, pode-se afirmar novamente a presença do material genético da porção NS5 do VFA, pois, caso o genoma não fosse correspondente, a construção filogenética reagiria de forma diferenciada, não possibilitando o encaixe das mesmas no clado correspondente como ocorreu com o grupo externo.
De acordo com Tajima (1989), com o teste D é plausível evidenciar possíveis eventos de expansão populacional. O teste D de Tajima foi utilizado para verificar se a neutralidade se mantém. Este teste analisou a influência das mutações sobre a história evolutiva das amostras estudadas. O desvio do equilíbrio neutro só ocorre quando estes valores são significativamente maiores ou menores que zero (TAJIMA, 1989).
Valores positivos de D sugerem a existência de um chamado gargalo populacional recente ou alguma forma de seleção balanceadora. Sendo assim, os valores negativos de D sugerem expansão populacional (TAJIMA, 1989).
Foi observado que o valor D de Tajima se manteve positivo, valor igual a 1,159570, assim sendo, as sequências analisadas por este método se mantém consistentes com a seleção de equilíbrio não ocorrendo mudanças significativas nas sequências que possam ser consideradas como polimorfismo genético, visto que a proteína NS5 do VFA possui característica altamente conservada.
As estimativas de divergência evolutiva geral e entre pares foi inferida e, foi possível observar que, na divergência geral não foram encontrados valores de distancia significativos, sendo assim, as sequências possuem alto nível de semelhança. Na análise de divergência entre pares de sequência os valores de distância foram similares aos da divergência geral, ficando apenas o grupo externo com a maior diferença significativa como esperado.
9 CONCLUSÃO
A triagem inicial utilizando métodos de diagnóstico sorológicos e moleculares permitiu a seleção de 118 amostras negativas para o presente estudo.
A extração e a padronização da RT-PCR foi realizada com êxito para a implementação nos ensaios.
A identidade dos amplicons pode ser confirmada por sequenciamento e alinhamento através do BLAST comprovando a autencidade dos amplicons obtidos para o vírus da Febre Amarela.
A análise filogenética possibilitou avaliar a relação íntima que as amostras do estudo tinham com as sequências do banco de dados Genbank, comprovando suas características filogenéticas e a similaridade entre as demais excluindo a existência de polimorfismos na região da NS5 estudada.
O Clado de Senegal com suporte estatístico de bootstrap foi o mais próximo com relação as sequências obtidas a partir das amostras.
A análise pelos testes D de Tajima e hipótese do relógio molecular verificou que não houve expansão populacional e demonstrou que não houve divergência entre as sequências analisadas
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