XXVIII Congresso de Iniciação Científica
Avaliação antifúngica e da expressão gênica de citocinas inflamatórias após Terapia Fotodinâmica em modelo murino de candidose oral.
Gabriela Cristina Zanatta, Ewerton Garcia de Oliveira Mima, Vinicius Tatsuyuji Sakima, Juliana Cabrini Carmello, Ana Cláudia Pavarina. Campus UNESP Araraquara, Odontologia,
gabrielaczanatta@foar.unesp.br. Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica (PIBIC).
Palavras Chave:fotoquimioterapia, citocinas, curcumina.
Introdução
A Curcumina (CUR), dentre suas diversas propriedades terapêuticas, tem sido utilizada também para inativação de Candida albicans (Ca)1 e em cicatrização de feridas2. Seu efeito antimicrobiano é potencializado quando utilizado como fotossensibilizador (FS) associado à luz em Terapia Fotodinâmica antimicrobiana (aPDT)1. Além disso, estudos demonstraram que a CUR apresenta efeitos positivos nos três estágios do processo de cicatrização tecidual2: inflamação, proliferação e remodelação. O efeito da CUR no estágio de inflamação de feridas é reduzir a produção de citocinas, como o fator de necrose tumoral α (TNF-α) e interleucina 1 (IL-1)2 e, consequentemente, reduzir o processo inflamatório e acelerar o processo de cicatrização. Entretanto, o efeito da aPDT mediada pela CUR na cicatrização de lesões infecciosas não é conhecido.
Objetivos
Avaliar o efeito antifúngico e de expressão gênica de citocinas inflamatórias após aPDT mediada pela CUR em um modelo murino de candidose oral.
Material e Métodos
CUR foi usada como FS em uma concentração de 260 µM preparado em 10% de DMSO. Um total de 60 camundongos fêmeas com 6 semanas foram imunossuprimidos e inoculados com uma cepa padrão de Ca (ATCC90028, 1x107 UFC/mL) por via oral. Os animais submetidos à aPDT receberam CUR aplicada no dorso lingual que, após 20 min, foi irradiado com uma fonte de luz LED (455 nm, 37,5 J/cm2, 7 min) (F+L+) durante 5 dias consecutivos.
Animais adicionais foram tratados somente com CUR sem luz (F+L-), Nistatina 1 vez ao dia (NIS1), Nistatina 4 vezes ao dia (NIS4) ou não receberam nenhum tratamento (F-L-). Após a última aplicação dos tratamentos, amostras da língua dos animais foram plaqueadas em meio de cultura específico (CFU/mL).
Após 24 h, os animais foram eutanasiados. A língua de cada animal foi removida para análise da expressão gênica por RT-qPCR das seguintes citocinas: TNF-α, IL-1 e IL6. As amostras foram submetidas à extração do material genético manualmente ou mecanicamente em processador seguido pelo método trizol:clorofórmio:álcool com amostras individuais ou pool de grupos. O RNA total foi purificado por meio do Kit Micro-Elute (Qiagen) e quantificado (260 nm). A integridade do RNA foi avaliada por gel de eletroforese. Para cada amostra de RNA total, foi sintetizado o cDNA utilizando o High
Capacityc DNA Reverse Transcriptase Kit (Applied Biosystems). qPCR foi realizado utilizando primers específicos para cada gene (actina como controle) e o kit Taqman Assays (AppliedBiosystems). Os dados foram analisados por ANOVA/Welch e post-hoc Games-Howell (α=5%).
Resultados e Discussão
Na avaliação antifúngica foi observada uma redução significativa de 1,19 log10 para o grupo aPDT (p=0,001), 2,59 log10 para o grupo NIS1 (p=0,001) em relação ao grupo F-L- e 1,39 log10 para o grupo NIS4
(p=0,001) (Figura 1).
Figura 1: Valores médios
de log10(UFC/mL) de Ca. Barras de erro:
desvio-padrão. Letras diferentes: diferença significativa (p<0,05).
Na avaliação da expressão gênica de citocinas inflamatórias, durante a etapa de extração do material genético por trizol, as amostras quantificadas individualmente durante o processo de maceração manual não apresentaram um rendimento suficiente (84,73% de perda de material genético) para dar continuidade com as etapas de síntese de cDNA. As amostras em pool e maceradas mecanicamente apresentaram degradação do RNA (Figura 2). Assim, não foi possível realizar o qPCR.
Conclusões
A aPDT mediada pela CUR foi efetiva na redução da viabilidade de Ca no modelo murino de candidose oral, porém a nistatina 1x/dia apresentou uma maior redução. A metodologia para extração do material genético ainda não foi validada.
Agradecimentos
PIBIC 38324, FAPESP 2013/23165-5, CNPq 446401/2014-5.___________________
1 Dovigo LN et al. Curcumin-mediated photodynamic inactivation of Candida albicans in a murine model of oral candidiasis. Med Mycol.
2013;51(3):243-51.
2 Akbik D et al. Curcumin as a wound healing agent. Life Sci.
2014;116(1):1-7.
A
B B B
A
Figura 2: Integridade de RNA da língua dos animais dos diferentes grupos.
