Ao meu grande amigo Juliano que sempre esteve ao meu lado, sendo amigo, irmão e conselheiro; Angela Malheiros, que sempre teve muita paciência no ensino, foi uma amiga, uma conselheira, sempre com muita luz e sabedoria, um exemplo de pessoa de quem tenho muito orgulho. Agradeço aos técnicos da UNIVALI Clarissa, Pedro, Samanta, Viviane, Deivissom, que sempre me ajudaram com muita dedicação em meu trabalho.
A atividade antioxidante in vitro foi verificada por testes de quantificação de fenólicos, ABTS, DPPH, FRAP, peroxidação lipídica e radical superóxido. ECFMR – Extrato de Casca de Fruta Madura Recém Colhida ECFMS – Extrato de Casca de Fruta Madura Seca. ECFVR – Extrato de Casca de Fruta Verde Recém Colhida ECFVS – Extrato de Casca de Fruta Verde Seca.
EFIMRH2O – Extrato aquoso de frutos inteiros maduros recém-colhidos. EFIMS – Extrato seco de frutos inteiros maduros. EPSFVR – Extrato de semente/polpa de fruta verde recém-colhida EPSFVS – Extrato de semente/polpa de fruta verde seca.
Objetivo Geral
Objetivos Específicos
METABÓLITOS PRIMÁRIOS
- CARBOIDRATOS
- LIPÍDIOS
Os polissacarídeos que após hidrólise resultam em um único monossacarídeo são classificados como homopolissacarídeos, enquanto aqueles classificados como heteropolissacarídeos geram misturas de monossacarídeos. Outra classificação que os polissacarídeos recebem é de acordo com sua função biológica, seja estrutural ou nutricional. Os lipídios das plantas têm grande impacto na economia mundial e também na nutrição humana.
As plantas contêm vários lipídios, incluindo ácidos graxos, fosfolipídios, glicolipídios, lipídios esterol, esfingolipídios e ceras. Os lipídios são classificados em lipídios simples (gorduras e ceras), lipídios complexos (fosfolipídios e glicolipídios) e lipídios derivados (ácidos graxos, glicerol, esteróis, colesterol e vitamina D) (BOWEN-FORBES; GOLDSON-BARNABY, 2017). Esses ácidos graxos podem ser de cadeia curta, média, longa ou muito longa, dependendo do número de átomos de carbono e 20-24 átomos de carbono, respectivamente).
Os ácidos graxos sem ligações duplas são descritos como saturados e com uma ou mais ligações duplas como mono e poliinsaturados, respectivamente (BOWEN-FORBES; GOLDSON-BARNABY, 2017). O ácido monoinsaturado mais difundido é o ácido oleico (C18) e o ácido linoléico (C18), o ácido linolênico (C18) e o ácido araquidônico (C20) são os ácidos graxos poliinsaturados mais difundidos.
METABÓLITOS SECUNDÁRIOS
- TERPENOS E ESTERÓIS
- ALCALOIDES
Nesse aspecto, alcalóides, compostos fenólicos, terpenos, carotenóides, entre tantos outros, são compostos que desempenham diversas funções no organismo, portanto são alvo de pesquisas voltadas ao desenvolvimento de medicamentos e fitoterápicos, visando a melhoria da saúde. da população (KUMAR et al., 2017). Os terpenos consistem em conexões de cinco unidades ramificadas de carbono baseadas em um esqueleto de isopentano (BIAN et al., 2017; CROTEAU; KUTCHAN; LEWIS, 2012; NIERO; MALHEIROS, 2016). O pré-tratamento com mentol em diferentes doses reduziu significativamente a formação e o crescimento tumoral, o que também inibiu a inflamação induzida pelo 12-O-tetradecanoilforo-13-acetato (TPA) ao suprimir a expressão da ciclooxigenase-2 (COX-2) (LIU et al., 2015b).
Os terpenos também reduziram a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS), indicando efeito protetor contra o estresse oxidativo (MA et al., 2011). Esses metabólitos têm como objetivo auxiliar a planta no processo de resistência a patógenos e predadores, além de demonstrar toxicidade a diversos organismos, como fungos, insetos e bactérias (CÁRDENAS et al., 2015). Porém, também apresentam efeitos benéficos ao organismo, com diversas aplicações farmacológicas como antioxidantes, antiinflamatórios, antibacterianos, antimaláricos, antiparasitários, sedativos, analgésicos, doenças neurodegenerativas e antitumorais (ALMOULAH et al., 2017; FUNAYAMA; CORDELL, 2014 ).
O gênero Solanum é conhecido por seu alto teor de alcalóides e já foi identificado em mais de 100 espécies diferentes (MUNARI et al., 2012). Por exemplo, quando a morte celular ocorre em linhagens tumorais específicas, o composto tem potencial anticancerígeno, e em células saudáveis, como os fibroblastos, a morte celular idealmente não deveria ocorrer, caso ocorra, o composto pode ser considerado citotóxico (DUSINSKA et. al., 2017).
PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS GERAIS
O perfil cromatográfico de extratos brutos e frações de cromatografia em coluna aberta foi realizado utilizando cromatografia em camada delgada (TLC) utilizando cromatoplacas de sílica gel 60 F254 de 20 μm preparadas em folha de alumínio Merck®. Diferentes misturas de solventes foram utilizadas para eluir as cromatoplacas, como hexano, acetato de etila, acetona, diclorometano e/ou metanol dependendo da polaridade das amostras, todas dos laboratórios VETEC® e SIGMA-ALDRICH®. Os reveladores químicos específicos usados no CCD incluíram anisaldeído em solução seletiva de ácido sulfúrico para esteróis e terpenos e Wagner e Dragendorff para alcalóides e/ou cloreto férrico para compostos fenólicos.
Para análise colorimétrica foi utilizada radiação ultravioleta através da cabine de revelação cromatográfica - DIST® (254-366nm). Os eluentes utilizados foram hexano, acetato de etila, etanol e metanol dos laboratórios VETEC® e SIGMA-ALDRICH®. Os espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (1H RMN) e carbono-13 (13C RMN) foram registrados em um espectrômetro Bruker, modelo DPX-300; 300 MHz para o núcleo de hidrogênio e 75 MHz para o núcleo de carbono-13.
Os espectros de correlação quântica única heteronuclear bidimensional (HSQC) e correlação de ligações múltiplas heteronucleares (HMBC) também foram utilizados para analisar os compostos. Os solventes utilizados para diluir as amostras foram clorofórmio e metanol deuterados, da Cambridge Isotope Laboratories® e água deuterada da Sigma-Aldrich® e tetrametilsilano (TMS) foi utilizado como padrão interno. As análises por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) foram realizadas em um cromatógrafo Shimadzu, conectado à bomba LC 20AT com detector SPD-M20A conectado ao injetor SIL-20AHT, detector de arranjo de diodos, modelo SPD-M20A e versão do software LC-Solution. 1,25.
A detecção de varredura espectral foi realizada na faixa de comprimento de onda entre 190 nm e 400 nm. Os extratos foram filtrados com filtro com membrana de celulose regenerada de 15 mm de diâmetro e porosidade 0,45 μm, marca Chromafil RC-45/15MS. Foram utilizadas duas colunas diferentes, C-8 e C-18, ambas da Phenomenex (250 x 4,6 mm) e com tamanho de partícula de 5 μm.
A fase móvel para análise qualitativa dos extratos das diferentes partes foi constituída por água e acetonitrila (ACN). Para os três gradientes testados foram utilizadas diferentes proporções de fase móvel, composta por Fase A: água acidificada (água ultrapura; pH 2,5 - 0,1% de ácido fórmico) e Fase B: acetonitrila, conforme Tabela 01.
MATERIAL VEGETAL
Os frutos verdes foram colhidos em fevereiro e os frutos maduros em abril e maio de 2014.
PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS
As soluções extrativas foram filtradas e o solvente removido por evaporação sob pressão reduzida em rotaevaporador em temperatura inferior a 50 ºC. O potenciômetro foi calibrado com soluções tampão fosfato e acetato, pH 7,0 e 4,0, respectivamente, para posterior determinação do pH das soluções extrativas.
ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DOS COMPOSTOS
ENSAIOS IN VITRO PARA DETERMINAÇÃO DE
- DETERMINAÇÃO DE FENÓLICOS TOTAIS PELO ENSAIO DE
- DETERMINAÇÃO DO TEOR DE FLAVONÓIDES
- DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE CAPTURA DE RADICAIS
- DETERMINAÇÃO DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE PELA
Para obtenção da faixa de linearidade do método, a curva analítica foi construída utilizando quercetina diluída em metanol como padrão (Y=0,0053X+0,0016; R2=0,9991). A determinação da atividade sequestradora de radicais livres foi realizada utilizando o método proposto por Brand-Williams et al. O método de análise do DPPH foi pela porcentagem de captura de radicais conforme fórmula: % Captura de Radicais = (Ac-At/Ac) x 100, onde Ac = absorbância do branco e At = absorbância do teste (amostras).
A absorvância foi realizada no comprimento de onda de 515 nm e as análises foram realizadas em triplicata. A determinação da capacidade antioxidante foi realizada pelo método do radical ABTS+ (ácido 2,2'azinobis-(3-etilbenztiazolina-6-sulfônico) conforme descrito por Re et al. O radical ABTS foi formado inicialmente com a reação com persulfato de potássio em temperatura ambiente, incubados e mantidos ao abrigo da luz por 16 horas.
As amostras foram diluídas em etanol e adicionado o radical ABTS e a leitura da absorbância foi em 734 nm, sendo os resultados expressos em Trolox mM por grama de extrato. O resultado foi expresso em percentual de inibição da absorção da solução ABTS, obtido pela fórmula: (Ac-At/Ac) x 100 onde Ac = absorbância do branco e At = absorbância do teste (amostras).
ENSAIOS IN VIVO
Perfil cromatográfico de extratos de frutos maduros recém-colhidos de S. diploconos. a) ECFMR, b) EPSFMR, c) EFIMR em λ = 320 nm. Perfil cromatográfico de extratos inteiros de frutos de S. diplokoni. a) EFIMR, b) EFIMS, c) EFIVR, d) EFIVS e e) EFIMRH2O em λ. Perfil cromatográfico de extratos de cascas de frutos de S. diplokoni. a) ECFMR, b) ECFMS, c) ECFVR e d) ECFVS em λ = 320 nm.
Perfil cromatográfico de extratos de polpa e sementes de S. diplokoni. a) EPSFMR, b) EPSFMS, c) EPSFVR e d) EPSFVS em λ = 320 nm. Ribeiro e cols. (2016) identificaram derivados de ácido cafeico, ferúlico e cumárico no extrato hidroetanólico de frutos de berinjela (S. melongena) conhecido por seu alto teor fenólico variando de 130 a 200 mg GAE/g. de acordo com o nível de maturação (NIÑO-MEDINA et al., 2017).
KAUR et al., (2014) realizaram uma avaliação do conteúdo fenólico, conteúdo de flavonóides e capacidade antioxidante (DPPH) de diferentes espécies de berinjela (madura) e variedades silvestres da espécie. Os parâmetros hematológicos e bioquímicos estão entre as respostas clínicas mais importantes quanto às alterações fisiológicas decorrentes da intoxicação pelos mais diversos compostos (ALMANÇA et al., 2011). Níveis elevados de enzimas hepáticas no soro são indicativos de dano celular hepático (REMYA et al., 2017).
A hemoglobina livre no plasma causa danos a diversos órgãos, como fígado, rim e coração (PEREIRA et al., 2016). O ensaio de citotoxicidade utilizando MTT permite quantificar a atividade celular, determinando assim a citotoxicidade de um produto (ONG et al., 2017). O composto Dimetilsulfóxido (DMSO) é um solvente frequentemente utilizado para diluir substâncias pouco solúveis em água em testes in vitro e in vivo (SCHULTZE et al., 2017).
A determinação do teor de fenólicos totais presentes nas amostras foi realizada pelo método de Folin-Ciocalteu proposto por Singleton et al. Para determinar a eliminação do radical superóxido na amostra EFlr, utilizou-se a técnica descrita por Silva et al. Um ensaio para determinar a inibição da peroxidação lipídica em EF1r foi realizado utilizando a metodologia proposta por Ohkawa et al.
Nota: Os dados de RMN da estrutura do glicosil-β-sitosterol proposto por (MATILDA et al., 1996) e da estrutura lipídica foram baseados no composto glicerílico oleodistearina (ALI et al., 2017). Esses dados são consistentes com aqueles encontrados por YUAN et al., (2017) que relataram esses dois alcalóides em espécies de Solanum, inclusive nas folhas de S. O ensaio de micronúcleo permite danos ao DNA e desequilíbrio entre verificar antioxidantes e ROS (HINTZSCHE et al., ., 2017).
A administração de doses superiores a 10% de DMSO é considerada tóxica (PENAZZI et al., 2016). Neste estudo, o DMSO foi utilizado como controle positivo, demonstrando uma viabilidade celular média de 15%, enquanto o controle negativo foi de 95.
