Os estudos de toxicidade foram realizados com Ratos Wistar, fêmeas, pesando entre 200 e 250 g. Os animais foram adquiridos no Biotério Central da UNIVALI, Itajaí, SC. Foi seguido o padrão sanitário convencional para os animais, e estes foram mantidos em uma sala com controle de temperatura (22
± 2 ºC) e umidade, com ciclos de escuro/luz (12:12 h), sistema de ventilação aberto. Receberam água e ração ad libitum, sendo realizada troca de camas a cada dois dias. Foram alocados 5 animais por gaiola. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes da Sociedade Brasileira de Ciência de Animais de Laboratório para o cuidado adequado e uso de animais de experimentação. Todos os experimentos foram aprovados pelo comitê de ética da Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, SC, Brasil (CEUA/UNIVALI:
protocolo nº 028/16).
1.6.2 Ensaios de toxicidade aguda – Dose fixa
O extrato etanólico dos frutos de S. diploconos foi administrado via oral na dose única de 2 g/kg em um grupo com 5 ratos Wistar fêmeas após 12 horas de jejum. O grupo controle recebeu veículo (água destilada). Após a administração do extrato os animais foram observados durante as primeiras 12 horas, nos períodos de 15, 30 e 60 minutos e a cada 4 horas. Os sinais tóxicos de caráter geral foram observados de maneira visual, sendo avaliados os seguintes parâmetros: atividade geral, frêmito vocal, irritabilidade, resposta ao toque, aperto da cauda, contorção, corporal, tônus corporal, força de agarrar, ataxia, tremores, convulsões, estimulações, cauda em straub, hipnose, anestesia, lacrimação, ptoses, piloereção, respiração e cianose. Para esta observação os animais foram mantidos em gaiolas em uma sala adequada com controle de temperatura. Os animais foram observados visualmente por 14 dias e o peso foi verificado nos 0, 7 e 14 dias após a administração do extrato. Água e ração
foram mensurados a cada 2 dias, sendo a água medido o volume e a ração o peso consumidos.
Após 14 dias foram observados o número de mortes e os animais que sobreviveram foram eutanasiados e necropsiados (OECD 420, 2001). A eutanásia foi realizada com os animais anestesiados com ketamina e xilasina e então foi realizada a coleta de sangue para as analises bioquímicas e hematológicas.
Foram observadas as características macroscópicas dos pulmões, rins, intestinos, fígado, baço e coração. O sangue foi coletado para análises dos parâmetros hematológicos e bioquímicos (glicose, aspartato aminotransferase, alanina aminotransferase, fosfatase alcalina, ureia, creatinina).
1.6.3 Ensaio de toxicologia subaguda (ensaio de doses repetidas)
Para este teste foram utilizados 4 grupos com 5 ratos Wistar fêmeas cada grupo. Os animais permaneceram por 24 horas para adaptação ao ambiente, sendo então, tratados com diferentes doses do extrato etanólico dos frutos de S. diploconos (30, 100 e 300 mg/kg). O grupo controle recebeu veículo (água destilada). O extrato foi administrado via oral (gavagem) durante 28 dias (administração diária) sempre no mesmo horário.
Após a administração do extrato os animais foram observados durante as primeiras 12 horas, nos períodos de 15, 30 e 60 minutos e a cada 4 horas. Os sinais tóxicos de caráter geral foram observados, sendo avaliados os seguintes parâmetros: atividade geral, frêmito vocal, irritabilidade, resposta ao toque, aperto da cauda, contorção, corporal, tônus corporal, força de agarrar, ataxia, tremores, convulsões, estimulações, cauda em straub, hipnose, anestesia, lacrimação, ptoses, piloereção, respiração e cianose.
Os animais foram observados por 28 dias e o peso foi verificado a cada 2 dias após a administração do extrato. O consumo de água foi mensurado usando uma proveta graduada e a ração foi pesada.
No final do período de observação, os animais foram mantidos em jejum durante a noite para então ser anestesiados e eutanasiados, foram observados o número de mortes e os animais que sobreviveram foram eutanasiados e necropsiados (OECD 420, 2001). Foram observadas as características macroscópicas dos pulmões, rins, intestinos, fígado, baço e coração. O sangue foi coletado para análises dos parâmetros hematológicos e
bioquímicos (glicose, aspartato aminotransferase, alanina aminotransferase, fosfatase alcalina, ureia, creatinina).
1.6.3.1 Análises hematológicas
As amostras de sangue foram coletadas via acesso venoso armazenadas em tubos Vacutainer® contendo EDTA, os testes hematológicos realizados conforme OECD (OECD 407, 2008) e incluiram hematócrito (Ht), hemoglobina (Hb), plaquetas totais, eritrócitos, leucócitos totais, neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos e basófilos foram realizadas com um contador de células automático (Cell Dyn 3700, Abott Laboratories, Minnesota, EUA).
1.6.3.2 Análises bioquímicas
Para as análises bioquímicas, o sangue foi coletado sem aditivos e foi centrifugado a 3000 g a 4 °C durante 10 min. O soro foi separado e armazenado a -20 °C até à sua utilização. Os parâmetros bioquímicos analisados foram colesterol total, glicemia, aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT) e fosfatase alcalina (FAL), uréia e creatinina foram determinados por ensaios colorimétricos com kits Labtest® (Minas Gerais, Brasil).
1.6.3.3 Peso dos órgãos e análises histológicas
Ao final dos experimentos os animais foram eutanasiados usando quetamina e xilazina (proporção 7,5/2,5 mg/ml) e o coração, baço, pulmão, rins e fígado foram retirados, secos em gaze e pesados em balança de precisão. Para cada órgão, o peso relativo foi calculado como: Peso do órgão/peso corporal do animal no dia do sacrifício x 100 %. Posteriormente, o fígado e o rim foram fixados em formaldeído, desidratados e embebidos em parafina usando um processador de tecidos automatizado. As seções (5 μm) foram coradas com hematoxilina e eosina (H/E) e examinadas sob microscópio. As fotografias foram tiradas com uma ampliação de 400 x.
A lesão renal foi baseada na degeneração do espaço de Bowman e glomérulos, degeneração dos túbulos proximal e distal, congestão vascular e edema intersticial. Os critérios para a lesão hepática foram vacuolização de hepatócitos e núcleos de hepatócitos picnóticos, o número de células de
Kupffer e alargamento da sinusóides. Além disso, a alteração histopatológica dos pulmões foi baseada na congestão, edema, inflamação e hemorragia.
1.6.3.4 Modelo Campo aberto (Ensaio do open field)
Os animais do experimento de toxicologia subaguda (doses de 30, 100, 300 mg e veículo) foram submetidos a duas sessões no teste do campo aberto, afim de avaliar a atividade exploratória e motora. O teste foi realizado em um aparato de acrílico medindo 90 cm de diâmetro e 50 cm de altura. O chão do aparato é dividido em 12 quadrados iguais. O número de quadrados cruzados com as quatro patas (crossing) e o número de levantamento (rearing) foram registrados para cada animal em uma sessão de 6 minutos, a qual foi realizada 60 minutos após a administração do extrato. Esse teste foi realizado duas vezes, sendo uma no início e outra ao final do experimento. O experimento foi filmado tendo-se assim, duas observações para cada animal (WALSH;
CUMMINS, 1976).
1.6.3.5 Modelo de Rota-rod
Os mesmos animais do experimento de toxicologia subagudo foram submetidos ao teste do Rota-rod. Este teste avalia a coordenação motora dos animais em função do tempo de permanência na barra acelerada. Os animais receberam via oral o extrato dos frutos uma hora antes do experimento, permanecendo na sala para ambientação, para então proceder o teste. Este foi realizado no 14º e 27º dia após o início do experimento. Cada animal foi inicialmente treinado por um período de 180 segundos, posicionado em uma barra giratória, em uma rotação constante de 10 rpm, sendo que quando o animal sofresse a queda da barra, era recolocado, por no máximo 5 quedas. O treinamento ocorreu um dia antes do experimento. No dia do experimento, cada animal foi treinado novamente por 60 segundos a uma rotação constante de 10 rpm, dando-se um intervalo de 15 minutos para então iniciar o teste. O teste ocorreu com a programação de velocidade acelerada, a qual inicia em 5 rpm chegando a 40 rpm em um tempo de 5 minutos. Foi observado o tempo de permanência do animal na barra, bem como, a rotação que o mesmo conseguiu atingir. O teste foi aplicado em 4 repetições com intervalos de pelo menos 15 minutos entre cada teste com cada animal (MANN; CHESSELET, 2014).
1.6.4 Atividade hemolítica
Atividade hemolítica do extrato foi avaliada de acordo com o método proposto por Sharma e Sharma (2001). O sangue foi coletado no experimento de toxicidade aguda descrito neste trabalho, sendo coletados em tubos heparinizados e centrifugados a 1000 g durante 15 minutos. O sedimento foi lavado três vezes com PBS (pH 7,4) gelado através de centrifugação a 1300 g durante 15 minutos e ressuspendidas com o mesmo tampão. Diferentes concentrações de extrato em PBS (0,1; 1; 10; 100 e 1000 µg/mL) foram adicionados à suspensão de eritrócitos e incubadas durante 1 h a 37 ˚C.
Após o período de incubação, as células foram centrifugadas e o sobrenadante foi usado para mensurar a absorbância da hemoglobina liberada em 540 nm. O valor médio foi calculado a partir de ensaios em duplicata. A hemólise completa foi conseguida utilizando 0,2 % de Triton X-100 obtendo-se o 100 % como valor de controle positivo.
Foram utilizados também tubos contendo apenas PBS como controle negativo. Menos de 10 % de hemólise foi considerada efeito não-tóxico. Os dados observados foram expressos como % de liberação Hb em comparação com 100 % de hemólise do mesmo número de células utilizando 0,2 % de Triton X-100.
1.6.5 Ensaio do micronúcleo
O ensaio do micronúcleo foi realizado 24 horas após a administração via oral do extrato de S. diploconos (2000 mg/kg). Para o controle negativo foi utilizado veículo (água destilada) e para o controle positivo Metil-Metano- Sulfóxido (MMS) (50 mg/kg via i.p). Após decorridas as 24 horas da administração o fêmur direito do rato foi removido e as epifeses foram cortadas. O canal medular foi lavado três vezes utilizando-se uma seringa com 1 mL de soro fetal bovino (SFB)
O material coletado foi submetido à centrifugação a 1000 g/10 min/5
oC até a obtenção da formação do precipitado. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi ressuspendido em 500 µL de meio de cultura. Desta suspensão foram realizados os esfregaços das células.
As lâminas foram fixadas com Metanol gelado e coradas com Giemsa durante 10 min, lavadas e secas para observação em microscópio. Foram
avaliados 500 eventos por lâmina sendo observados o número de eritrócitos monocromáticos (EM) e policromáticos (EPC), a proporção entre estes e a avaliação de eritrócitos contendo micronúcleo (EPCMN) (OECD 474, 2014).
1.6.6 Ensaio de viabilidade celular
As células de fibroblasto murino do clone NCTC 929 [L CELL, L- 929] (derivado de tecido normal e subcutâneo de tecido adiposo) foram obtidas do banco de células do Rio de Janeiro (BCRJ-0188). Estas foram cultivadas em DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), suplementado com 10 % de soro de fetal bovino, incubadas a 37 °C com 5 % de CO2. Após a cultura se tornar confluente (aproximadamente 48 h), as células foram coletadas e sub- cultivadas.
As células de fibroblasto L929 foram semeadas a uma densidade de 1x105 células/poço em placas de 96 poços e incubadas a 37 °C com 5 % de atmosfera de CO2 durante 24 h para completar a confluência. Após, as células foram expostas ao extrato etanólico dos frutos de S. diploconos (0,1; 1; 10 e 100 μg/mL) ou DMSO (10 %) como controle positivo, e incubadas novamente nas mesmas condições. A solução de sal de tretrazólio (ensaio de MTT) (5 μg/mL) foi adicionada diretamente ao meio em cada poço e a placa foi incubada a 37 °C durante 4 h. Todo o meio foi então aspirado e substituído por dimetilsulfóxido (DMSO), e a densidade óptica a 570 nm foi registrada. A porcentagem de células viáveis foi calculada e comparada com um controle negativo. Os resultados foram expressos como a porcentagem de viabilidade celular em relação ao controle (células não irradiadas – 100 % de viabilidade).
1.7 Análise estatística dos dados
Os resultados estão apresentados como média ± desvio padrão da média. A comparação estatística dos dados foi realizada utilizando análises de variância (ANOVA unidirecional) seguido do teste de Tukey para avaliar diferenças significativas entre os grupos. Os valores de p <0,05 foram considerados significativos.
2 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os frutos de S. diploconos vem sendo considerados Plantas Alimentícias Não Convencionais (PANC). Estes frutos ainda são pouco conhecidos quanto as suas propriedades nutricionais, assim como são poucos os estudos químicos e não se tem dados a respeito da segurança. Por isso, este trabalho pretendeu identificar a composição química e avaliar a segurança dos frutos.
2.1 Análise dos extratos
Os frutos de S. diploconos foram classificados em maduros, aqueles com coloração amarela. Já os frutos não maduros foram classificados como verdes. Parte destes foram utilizados in natura e parte foi submetido ao processo de secagem. Alguns frutos foram divididos em casca e polpa com sementes. Cada lote foi submetido à extração com etanol (95 ºGL) com o intuído de avaliar diferenças na composição química. Na tabela 01 estão apresentados os extratos com os respectivos códigos e porcentagens de massas obtidas, assim como o pH das soluções extrativas. Os extratos dos frutos maduros e verdes secos apresentaram rendimentos semelhantes (15,75 e 14,39
%) superiores aos recém-colhidos (11,49 e 10,09 %), aproximadamente 30 % de diferença. Quando cascas e polpa foram avaliadas separadamente foi observado que aproximadamente 60 % do material extraído está na polpa e semente e aproximadamente 40 % está na casca. Já diferença de massa dos extratos das cascas e polpas secos e recém-colhidos foi de aproximadamente 50
%.
Ribeiro et al., (2016) avaliaram polpa e cascas liofilizadas de S.
diploconos, assim como o extrato etanólico do fruto inteiro, porém, não apresentaram informações com relação aos rendimentos. Na literatura foram encontrados alguns trabalhos com frutos de Solanum, Vaz (2008) selecionou frutos imaturos de S. caavurana Veel., frutos imaturos de S. scuticum e partes aéreas de S. diploconos. Os rendimentos para o extrato etanólico foram 13,2;
6,5 e 12,8 % respectivamente. Os rendimentos obtidos com os frutos imaturos de S. scuticum são similares aos encontrados neste trabalho.
Tabela 01. Descrição das partes utilizadas para o preparo dos extratos, rendimento percentual, pH e as metodologias as quais foram submetidas dos frutos de S. diploconos.
Extrato parte fruto Sigla pH Rendimento
(%) Extrato Fruto Inteiro Maduro
Recém-Colhido
EFIMR 3,12 11,49
Extrato Fruto Inteiro Maduro Seco EFIMS 2,64 15,75 Extrato Fruto Inteiro Verde Recém-
Colhido
EFIVR 3,19 10,09
Extrato Fruto Inteiro Verde Seco EFIVS 2,25 14,39 Extrato Cascas do Fruto Maduro
Recém-Colhido
ECFMR 3,28 6,59
Extrato Cascas do Fruto Maduro Seco
ECFMS 2,90 11,42
Extrato Cascas do Fruto Verde Recém-Colhido
ECFVR 2,92 6,68
Extrato Cascas do Fruto Verde Seco ECFVS 3,13 10,44 Extrato Polpa/semente Fruto Maduro
Recém-Colhido
EPSFMR 3,09 10,12
Extrato Polpa/semente Fruto Maduro Seco
EPSFMS 3,01 Extrato Polpa/semente Fruto Verde
Recém-Colhido
EPSFVR 3,32 10,63
Extrato Polpa/semente Fruto Verde Seco
EPSFVS 2,83 19,70
Extrato aquoso dos Frutos Inteiros Maduros Recém-colhidos
EFIMRH2O 3,69 4,98
Considerando que os frutos são consumidos in natura ou na forma de sucos, foi realizado um extrato aquoso a partir dos frutos maduros recém- colhidos para comparação dos rendimentos e composição química. O rendimento do extrato aquoso foi de 4,98 % enquanto o extrato etanólico da mesma parte analisada foi de 11,49 %. Devido a esta diferença no rendimento foi utilizado etanol para a realização dos procedimentos deste estudo, tendo em vista que não foram observadas diferenças na constituição química entre eles.
Outra análise realizada foi a determinação do pH das soluções extrativas (Tabela 01). Os valores do pH dos frutos e suas partes permaneceram entre 2,64 a 3,69, sendo semelhante aos valores de pH da acerola in natura (3,07) (OLIVEIRA et al., 1999) e de polpas de maracujá congeladas (2,67 a 3,77) e in natura (2,54 a 2,58) (RAIMUNDO et al., 2009).
De maneira geral, as plantas comestíveis destinadas ao homem e aos animais apresentam caráter ácido, cujo valor varia em limites muito amplos de pH. O pH dos alimentos não tem significado decisivo para o balanço ácido- básico do organismo, a não ser que a acidez seja conferida por substâncias não metabolizáveis, como é o caso do ácido benzoico (MELCHART et al., 2016).
Os extratos foram inicialmente avaliados por CCD (dados não apresentados). Estes apresentaram perfil similar e característica muito polar. A partir desta constatação optou-se por avaliar os extratos por CLAE. Para o desenvolvimento do método foi utilizado o EFIMR. O método inicial foi baseado no estudo realizado por Ribeiro et al., (2016). O primeiro método testado foi denominado Gradiente 01. A fase móvel foi constituída por água acidificada (água ultrapura; pH 2,5 -ácido fórmico a 0,1) e acetonitrila nas proporções iniciais de 95:05 % (fluxo constante de 1,0 mL/min. A coluna utilizada foi uma coluna C-18, portanto o processo consistiu em fase reversa.
Este procedimento não foi eficiente para a separação dos picos.
O segundo método testado foi denominado de Gradiente 02. Neste procedimento foi utilizado uma coluna C-8 e também ocorreram mudanças nas proporções da composição da fase móvel, como demonstrado no quadro 01.
Este método foi eficiente para a separação dos picos, no entanto, alguns ajustes foram realizados para obter uma melhor separação. No método denominado Gradiente 03, foi realizada a mudança apenas na proporção da fase móvel a partir dos 30 minutos de eluição. O gradiente 03 foi o que apresentou melhor separação dos picos, sendo este o método selecionado para proceder as análises dos extratos.
Com o intuito de estabelecer o comprimento de onda específico para as análises uma varredura foi realizada entre 220 e 400 nm. Considerando que a maioria dos picos apresentaram maior absorção em 320 nm, este foi escolhido para análise dos extratos. Na figura 01 estão os cromatogramas dos extratos EFIMR, EPSFMR e ECFMR. Uma grande quantidade de picos entre 10 a 30 minutos foi observada. A maioria dos picos se distribui uniformemente entre polpa e casca, exceto o composto com tempo de retenção de 15 minutos. Este é o majoritário do extrato e encontra-se somente nas cascas.
Figura 01. Perfil cromatográfico dos extratos dos frutos maduros recém colhidos de S. diploconos. a) ECFMR, b) EPSFMR, c) EFIMR em λ = 320 nm.
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 m in
-25 0 25 50 75 100 125 150 175
m AU320nm,4nm (1.00)
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 m in
-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50m AU
320nm,4nm (1.00)
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min
-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
mAU320nm,4nm (1.00)
Todos os extratos obtidos foram avaliados por CLAE no gradiente 03.
Esta divisão foi realizada para verificar se havia diferentes compostos nos a) ECFMR
b) EPSFMR
c) EFIMR
frutos verdes e maduros além de verificar alguma alteração na composição entre as partes secas em estufa e recém-colhidos. Nas figuras 02, 03 e 04 estão os cromatogramas dos extratos dos frutos inteiros, cascas e polpa, respectivamente. Independente do processo em que os extratos foram preparados, observa-se similaridade de perfil químico. No entanto, as intensidades de alguns picos apresentaram diferenças significativas em suas concentrações, especialmente para os frutos maduros secos (Figura 02.)
Figura 02. Perfil cromatográfico dos extratos dos frutos inteiros de S.
diploconos. a) EFIMR, b) EFIMS, c) EFIVR, d) EFIVS e e) EFIMRH2O em λ
= 320 nm.
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 m in
-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
m AU 320nm,4nm (1.00)
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 m in
-5 0 5 10 15 20 25
m AU320nm,4nm (1.00)
a) EFIMR
b) EFIMS
...continuação figura 02
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 m in
-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40
m AU 320nm,4nm (1.00)
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 m in
-2.5 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5
m AU320nm4nm (1.00)
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 m in
-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40
m AU 320nm,4nm (1.00)
c) EFIVR
d) EFIVS
e) EFIMRH2O
Figura 03. Perfil cromatográfico dos extratos das cascas dos frutos de S.
diploconos. a) ECFMR, b) ECFMS, c) ECFVR e d) ECFVS em λ = 320 nm.
0 .0 5 .0 1 0 .0 1 5 .0 2 0 .0 2 5 .0 3 0 .0 3 5 .0 4 0 .0 m in
-2 5 0 2 5 5 0 7 5 1 0 0 1 2 5 1 5 0 1 7 5
m AU 320nm,4nm (1.00)
0 .0 5 .0 1 0 .0 1 5 .0 2 0 .0 2 5 .0 3 0 .0 3 5 .0 4 0 .0 m in
0 2 5 5 0 7 5 1 0 0
m AU 320nm,4nm (1.00)
0 .0 5 .0 1 0 .0 1 5 .0 2 0 .0 2 5 .0 3 0 .0 3 5 .0 4 0 .0 m in
-5 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5 5 0m AU
320nm,4nm (1.00)
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 m in
-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40
m AU 320nm,4nm (1.00)
c) ECFVR a) ECFMR
b) ECFMS
d) ECFVS
Figura 04. Perfil cromatográfico dos extratos das polpas e sementes de S.
diploconos. a) EPSFMR, b) EPSFMS, c) EPSFVR e d) EPSFVS em λ = 320 nm.
0 .0 5 .0 1 0 .0 1 5 .0 2 0 .0 2 5 .0 3 0 .0 3 5 .0 4 0 .0 m in
-5 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0m AU
320nm,4nm (1.00)
0 .0 5 .0 1 0 .0 1 5 .0 2 0 .0 2 5 .0 3 0 .0 3 5 .0 4 0 .0 m in
-5 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5
m AU320nm,4nm (1.00)
Em função das similaridades encontradas nos extratos foi realizada a análise do perfil de absorção no UV dos principais picos do cromatograma do EFIMR (Figura 05).
0 .0 5 .0 1 0 .0 1 5 .0 2 0 .0 2 5 .0 3 0 .0 3 5 .0 4 0 .0 m in
-5 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5
m AU 320nm,4nm (1.00)
0 .0 5 .0 1 0 .0 1 5 .0 2 0 .0 2 5 .0 3 0 .0 3 5 .0 4 0 .0 m in
-5 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5 5 0m AU
3 20 n m,4n m (1 .0 0 )
a) EPSFMR
b) EPSFMS
c) EPSFVR
d) EPSFVS
Figura 05. Cromatograma do extrato EFIMR de S. diploconos e respectivos espectros de absorção no UV em λ = 320 nm.
0 1 0 2 0 3 0 4 0 m in
0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5 5 0
m AU3 20 n m4 nm (1 .00 )
1 2 3 4 5 6 7 89 1011 121314 1516 17 181920212223 24
Picos Espectro UV Picos Espectro UV
1; 2; 3;
4; 6; 7;
8; 9 e 10
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 nm
0 250 500 750 1000 1250 1500 1750mAU 3.24
194 666 718
645
524
14; 15;
17
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 nm
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 mAU 21.79
207 287 640
425 590
5; 11; 12
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 nm
0 25 50 75 100 125 150 175 200 mAU 14.89
204 326 640
481
23
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 nm
0 5 10 15 20 25 30 35 mAU 25.40
219 287 658
400 640
13; 16;
18; 19;
20; 21 e 22
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 nm
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110mAU 20.97
207 296 658
435424
24
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 nm
-10 -5 0 5 10 15 20 25 mAU 26.56
223 327 658
401 640
Observou-se seis perfis de absorção distintos no UV. O primeiro perfil refere-se aos picos 1 e 2. Neste observa-se o máximo de absorção em 210 nm.
Isto indica compostos com poucos grupos cromóforos. Assim como os picos 4, 5, 6, 7, 8 e 9 também apresentam perfis de absorção semelhantes além dos picos 10, 11, 12, 13 e 15. Os picos 14, 16 e 17; 18 e 19 e os picos 20, 21, 22, 23 e 24 também foram semelhantes entre si.
Os perfis de absorção indicam natureza aromática para a maioria dos compostos. Ribeiro et al., (2016) identificaram derivados de ácidos cafeico, ferúlico e cumárico no extrato hidroetanólico dos frutos de S. diploconos. O perfil apresentado é muito similar aos apresentados acima. Isto corrobora com os resultados aqui obtidos.
Os extratos EFIMR, EFIVR, EFIMS e EFIVS também foram analisados por RMN 1H, conforme apresentado na figura 06. No espectro de RMN 1H predominam sinais na região 2,50 a 4,5 ppm indicativo de hidrogênios ligados a carbonos oxigenados. Os dubletos em 5,40; 5,12 e 4,60 ppm são característicos de H anoméricos de açúcares. Se destacam nos espectros sinais em 2,8 ppm como quartetos. Também são observados sinais entre 0,7 a 2,5 ppm. Nesta região são encontrados hidrogênios de grupamentos alifáticos.
Figura 06. Espectros de RMN 1H dos extratos dos frutos inteiros de S.
diploconos. a) EFIMR, b) EFIVR, c) EFIMS e d) EFIVS (MeOD; 300 MHz, TMS).
a) EFIMR
b) EFIVR
c) EFIMS
...continuação figura 06
O extrato EFIMR foi avaliado ainda por RMN 13C, e a figura 07 mostra sinais entre 60 a 110 ppm característico de CH e CH2, além de um sinal em 46 ppm (CH2) e outro em 174 ppm (C). Estes sinais confirmam a natureza glicosídica do extrato. Os sinais que podem ser atribuídos a hidrogênios e carbonos aromáticos podem estar muito próximos a linha de base dos espectros, sendo estes os minoritários no extrato.
Pode-se dizer que os aromáticos estão em baixa concentração quando comparados aos compostos glicosídicos.
Figura 07. Análise do extrato EFIMR por Ressonância Magnética Nuclear de
13C/DEPT. (MeOD; 75 MHz, TMS).
d) EFIVS
2.2 Identificação dos compostos obtidos do extrato EFIMR
O EFIMR foi submetido ao processo de separação dos constituintes por CCA com a finalidade de identificar os compostos. As frações que apresentaram semelhança no perfil por CCD foram reunidas e posteriormente algumas foram encaminhadas à análises espectroscópicas de RMN. Na tabela 02 encontram-se os rendimentos de cada fração em massa e em %, também as análises realizadas por RMN.
Tabela 02. Frações obtidas da coluna cromatográfica do EFIMR de S.
diploconos com rendimento em massa e percentual e as análises realizadas em cada fração.
Fração Código Massa (mg)
Rendimento
%
RMN
1-11 1 1,00 0,01
12-17 2 2,00 0,02
18-21 3 2,00 0,02
22-26 4 2,00 0,02
27-31 5 2,00 0,02
32-36 6 2,00 0,02
37-40 7 2,00 0,02
41-46 8 4,00 0,04
47-56 9 9,00 0,09
57-62 10 15,00 0,15
63-65 11 15,00 0,15
66-68 12 7,00 0,07
69-75 13 224,00 2,24
76-80 14 168,00 1,68 X
81-91 15 202,00 2,02 X
92-97 16 167,00 1,67 X
98-103 17 2.074,00 20,74 X
104-105 18 875,00 8,75
106-108 19 969,00 9,69
109-113 20 413,00 4,13 X
113-124 21 30,00 0,30
125-150 22 34,00 0,34
Total 52,19
As frações denominadas 1-4 eluidas com hexano e acetato de etila e as fraçõs 5 a 12 eluidas com acetato de etila e etanol apresentaram rendimentos