Tese (Doutorado) - Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes. A análise dos compostos Fr40 por HPLC-DAD e co-injeção de padrões, além de TLC, identificou isovitexina e isoorientina nesta fração.
Produtos naturais: plantas medicinais
Alguns estudos exploraram as razões pelas quais as pessoas usam plantas medicinais (Harnack et al., 2001; Yoon et al., 2004; Albuquerque et al., 2007). Outra razão para seu uso ocorre quando o medicamento prescrito pelo médico é muito caro ou indisponível (Calixto, 2000; Ribeiro et al., 2005; Van Andel et al., 2010).
Metabolismo secundário
Os derivados de acetato podem ser classificados de acordo com as seguintes vias: o ciclo do ácido cítrico através do produto de condensação do mevalonato e do acetato (Bruneton et al., 2007). Quimicamente, os compostos fenólicos são definidos como substâncias que possuem um anel aromático com um ou mais substituintes hidroxila, incluindo seus grupos funcionais (Lee et al., 2005).
Família Alismataceae
Echinodorus macrophyllus
Além disso, nossos resultados demonstraram potencial antiinflamatório agudo do extrato aquoso, quando testado no modelo de edema de pata induzido por carragenina, iniciando o fracionamento do extrato aquoso de Echinodorus macrophyllus (EAEm), biomonitorado para esta atividade, rendendo uma dissertação de mestrado (Castro, 2006). Análises de DNA de células renais mostraram alguma atividade genotóxica para as doses mais altas de E testadas.
Fitoquímica
A utilização conjunta de técnicas espectrais, como ultravioleta (UV), infravermelho (IR), ressonância magnética nuclear (RMN) 1H e 13C combinada com o uso de técnicas sofisticadas de RMN (NOE, COSY, HETCOR, INADEQUATE, etc.) tem permitido propor com segurança a estrutura molecular de substâncias naturais. Além disso, o uso da difração de raios X, quando possível, permite avaliar a real estereoquímica dessas substâncias (revisado por Cechinel e Yunes, 1998).
O papel dos produtos naturais no desenvolvimento de novos
Das 877 novas entidades químicas - pequenas moléculas - (NEQs) introduzidas entre 1981 e 2002, cerca de metade (49%) provinha de produtos naturais, análogos semi-sintéticos de produtos naturais, ou compostos sintéticos com farmacóforo à base de produtos naturais (Koehn e outros, 2005). Como um pequeno número de novos compostos que estão de alguma forma relacionados com produtos naturais passaram pelas fases pré-clínicas e clínicas e chegaram ao mercado como medicamentos, a indústria farmacêutica tem investido em métodos de investigação melhorados para desenvolver novas entidades químicas bioactivas (bioNEQs) com potência terapêutica eficaz. (Yunes e Cechinel, 2001). Em relação aos compostos da biblioteca produzidos por métodos combinatórios, eles às vezes atendem a certas características, mas sempre se devem principalmente ao alto peso molecular, à ação lipofílica e à presença de nitrogênio e enxofre em sua composição (Hübel et al., 2008).
Nocicepção (Dor)
Descrição dos tipos de dor
A dor crônica persiste por mais de três meses e é um processo patológico que afeta fisiologicamente o indivíduo. Para o estudo da dor crônica, existe, por exemplo, o modelo de artrite em ratos, que afeta o sistema nervoso central ou periférico (Le Bars et al., 2001; Breivik et al., 2006). Anualmente, estima-se que o custo da dor crónica para a Europa seja de 200 mil milhões de dólares e para os EUA mais de 150 mil milhões de dólares.
Algesia, analgesia e analgésicos
As fibras amielínicas C terminam nas lâminas I, II e V do corno dorsal, enquanto as fibras mielinizadas A-δ terminam nas lâminas I e II e também penetram mais profundamente nas lâminas V e X (Bonica et al., 1990). Os opioides são metabolizados principalmente no fígado, onde são normalmente convertidos em compostos polares mais ativos ou inativos. Conforme mostrado na Figura 13, os analgésicos tradicionais atuam em diferentes pontos da via descendente da dor.
Resposta Antinociceptiva
Os analgésicos não opioides incluem antiinflamatórios não esteróides (AINEs), como aspirina e paracetamol. Eles são usados para aliviar a dor em estruturas não occipitais, como dor de cabeça, mialgia e outras dores pós-operatórias, como antipirético e proporcionar alívio da dor associada à inflamação. Neste estudo, objetivamos avaliar algumas vias de ação antinociceptiva utilizando modelos experimentais, a fim de melhor compreender o mecanismo de redução da dor das frações mais ativas de E.
Geral
Específico
Material
- Material Vegetal
- Animais
- Material descartável, reagentes, soluções, vidrarias especiais e
- Equipamentos e software
Placas de cultura estéreis de 96 poços de fundo plano com tampa, Falcon, Beckton Dickinson Labware, EUA;. Cromatógrafo gasoso, modelo Shimadzu 17A acoplado a espectrômetro de massas, modelo Shimadzu QP 2010plus com detector de energia de ionização de 70 eV, Shimadzu, Japão;. Cromatógrafo líquido de alta eficiência (HPLC-DAD), com sistema controlador DAD-3000 acoplado a detector fotodiodo (UV-VIS-DAD), Modelo UltiMate 3000, Thermo Scientific Dionex, EUA;.
Métodos
Obtenção dos extratos
Fracionamento do EAEm
Cromatografia em camada delgada de alta eficiência (HPTLC)
A cromatografia foi realizada em tanque de vidro com tampa, à temperatura ambiente, utilizando como fase móvel as seguintes misturas de solventes: acetato de etila: diclorometano: ac. Para verificar a presença de flavonóides, as placas foram secas e reveladas com o reagente NP:PEG ao final da corrida. As placas foram imediatamente reveladas com 0,5 g% de NP em acetato de etila e, após secagem a frio, pulverizadas com 5 g% de PEG em diclorometano e aquecidas a 105°C por 3 minutos.
Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de
Análise por cromatografia em fase gasosa acoplada a
Para estudar o mecanismo de ação dos opioides foi utilizado o modelo de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético descrito no item 3.2.5, conforme método descrito por Koster e colaboradores (1959). A atividade antinociceptiva de EAEm e EHEm também foi analisada no modelo de formalina que apresenta duas fases (Figura 16). No modelo de imersão da cauda em banho a 50ºC, o tratamento com EHEm apresentou eficácia na dose de 50 mg/kg aos 60 e 90 minutos (Figura 18A).
O mecanismo adrenérgico foi avaliado (Tabela 3) utilizando o modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético e utilizando a ioimbina como antagonista e a clonidina como agonista. O envolvimento do óxido nítrico (NO) no efeito antinociceptivo do Fr40 foi avaliado (Tabela 5) utilizando o modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético e utilizando 7-NI, um antagonista da NO sintase neuronal. O possível envolvimento da ativação da guanilato ciclase e da geração de cGMP foi avaliado (Tabela 4) utilizando o modelo de contorções abdominais induzido por ácido acético e utilizando ODQ como inibidor enzimático.
No modelo de formalina, EHEm, EAEm e suas frações Fr20 e Fr40 inibiram as fases neurogênica e inflamatória.
Modelo de formalina (injeção intraplantar de agente irritante)
Modelo de imersão da cauda em banho a 50ºC
Para estudar o mecanismo de ação adrenérgica, foi utilizado o modelo de contorção abdominal induzida pelo ácido acético descrito na seção 3.2.5, de acordo com o método descrito por Koster et al.(1959). Os animais foram separados em diferentes grupos de cinco animais, onde a água e a ração foram retiradas 1 h antes do teste: 1) Grupo controle recebeu (v.o.) o veículo de diluição Fr40 (água); 2) Um grupo foi tratado s.c. O possível envolvimento da ativação da guanilato ciclase e da geração de monofosfato de guanosina cíclico (cGMP) na resposta antinociceptiva do Fr40 foi avaliado (Tabela 4) utilizando o modelo de distensões abdominais induzidas por ácido acético e utilizando ODQ como inibidor do guanilato enzima ciclase. O próximo passo foi o biomonitoramento utilizando modelos experimentais de nocicepção, como distensão abdominal induzida por ácido acético, modelo de formalina e modelo de imersão da cauda em banho a 50ºC (teste de movimento da cauda ou imersão da cauda).
O modelo de torção abdominal induzida por ácido acético adaptado de Koster et al. (1959) é um método rotineiramente usado e sensível para examinar a eficácia de analgésicos periféricos, sendo este modelo mais sensível a analgésicos não esteróides (Collier et al., 1963). O objetivo foi avaliar algumas das vias de ação antinociceptiva usando o modelo de contorções induzidas por ácido acético a 0,06% com tratamento agonista e antagonista para melhor compreender o mecanismo de redução da dor induzida por Fr40 E. 50 °C, o tratamento com EHEm mostrou eficácia apenas em Tratamento com 50 mg/kg (60 e 90 min), enquanto EAEm não teve atividade.
O Fr40 apresentou atividade antinociceptiva em todos os modelos avaliados e menor citotoxicidade, sendo por isso escolhido para estudar seu mecanismo de ação no modelo de ácido acético, na dose de 25 mg/kg, que foi a dose mais ativa nos testes avaliados;
Estudo do mecanismo opiáceo
Estudo do mecanismo adrenérgico
Para reforçar esta ideia, outros estudos demonstraram que flavonóides como a rutina, a quercetina e a luteolina apresentam atividade antinociceptiva muito significativa (Deliorman et al., 2007). Eles estão localizados nos núcleos pontinos, amígdalas, bulbo olfatório, córtex cerebral profundo e neurônios sensoriais periféricos (Martins et al., 2012). Isto provoca uma hiperpolarização deste neurônio, o que bloqueia parcialmente a transmissão do estímulo doloroso (Martins et al., 2012).
Esta observação deu origem à hipótese de que a administração de clonidina tem um efeito antinociceptivo (Heyneman et al., 2000; Mason, 2004). Autores relatam que o NO pode induzir efeitos pronociceptivos e antinociceptivos dependendo das condições experimentais (Sakurada et al., 1996).
Estudo do mecanismo envolvendo a via NO-GMPc
Análise estatística
A segunda fase (fase inflamatória), que inclui o período de 15 a 25 minutos após a injeção de formalina, corresponde à dor inflamatória, com liberação de mediadores nociceptivos (Murray et al., 1988; Tjϕlsen et al., 1992). A fitoterapia é uma classe de medicamentos amplamente utilizada no país e representa um mercado potencialmente crescente (Carvalho et al., 2008). A hiperalgesia induzida pelo ácido acético é explicada pela liberação e aumento do nível de diversos mediadores, como histamina e serotonina, que atuam estimulando neurônios nociceptivos periféricos (Cui et al., 2010).
Acredita-se que a primeira e a segunda fases reflitam a excitação dos nociceptores aferentes periféricos e a sensibilização central, respectivamente (Dickenson e Sullivan, 1987; Yaksh et al., 2001). Estudos mostram que a ativação dos receptores α-2 adrenérgicos periféricos pela clonidina reduz a liberação local de catecolaminas, reduzindo a dor e a alodinia (Heyneman et al., 2000; Mason, 2004).
Rendimento da obtenção do EAEm, EHEm e OEEm
Estudos in vivo
Modelo de hiperalgesia induzida por injeção intraperitoneal (i.p.) de
Para o tratamento com EHEm, foi observada inibição significativa no número de contrações induzidas pelo ácido acético em todas as doses testadas, com percentual de inibição de 35% em relação ao grupo controle (Figura 14B). Os resultados representam a média ± DP de três experimentos e são estatisticamente significativos quando comparados com veículo (controle) e controle tratado com dipirona (vo) 60 min antes da injeção de ácido acético a 0,6% (i.p.). Os resultados representam a média ± DP de três experimentos e são estatisticamente significativos quando comparados ao controle (v.o.) tratado com veículo e dipirona 60 min antes da injeção de ácido acético a 0,6% (i.p.).
Modelo de formalina (injeção intraplantar de agente irritante)
A fração Fr20 (Figura 17A) foi ativa em ambas as fases do modelo de formalina, alcançando uma redução de 100% na nocicepção nas doses de 50 e 100 mg/kg na fase inflamatória. Na primeira fase foi observado efeito em forma de U invertido, com maior inibição (81,7%) na dose de 25 mg/kg.
Modelo de imersão da cauda em banho a 50ºC
A dipirona teve efeito predominante na 2ª fase deste modelo, inibindo em média 80,4% do número de guloseimas e mordidas e 40,5% na 1ª fase.
Estudos in vitro
Ensaio de citotoxicidade – Teste de redução do MTT
Estudo do mecanismo de ação
- Avaliação do mecanismo opiáceo
- Avaliação do mecanismo adrenérgico
- Avaliação do mecanismo de inibição da guanilato ciclase
- Avaliação do mecanismo de inibição da NO sintase neuronal
O Fr40 reduziu o número de distorções em 75,13% em comparação ao grupo controle e seu efeito foi revertido em 60,2% pela ioimbina. O Fr40 reduziu o número de distorções em 75,13% em relação ao grupo controle e seu efeito não foi revertido pelo ODQ. O Fr40 reduziu o número de distorções em 75,13% em relação ao grupo controle, e seu efeito foi parcialmente revertido (65,4%) pelo 7-NI.
Análises fitoquímicas
Perfil cromatográfico EHEm por GC-MS e identificação de seus
Os resultados expressam a torção média ± desvio padrão de dois experimentos avaliados entre 5-15 minutos após a injeção ip. Legenda: Cromatograma EHEm obtido por cromatografia gasosa em coluna DB-1 (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm) com nitrogênio como gás de arraste. IR = índice de retenção calculado; IRLit = Índice de Retenção de Dados Literários; * Linoleato de etila.
Cromatografia em camada delgada de alta eficiência (HPTLC)
Legenda: As cromatografias foram reveladas em placa HPTLC de sílica gel 60 de 3 x 7 cm, tendo acetato de etila: diclorometano: ac como solvente.
Perfis cromatográficos do EAEm, Fr20 e Fr40 por HPLC-DAD
Perfil cromatográfico da Fr40 por HPLC-DAD com co-injeções de
- Co-injeção de isovitexina
- Co-injeção de vitexina
- Co-injeção de isoorientina
Além disso, as empresas farmacêuticas investem cada vez mais em formulações à base de plantas para o tratamento de diversas doenças e distúrbios em todo o mundo (Johnson et al., 2003). Enquanto a primeira fase (fase neurogênica) e a segunda fase (fase inflamatória) são atenuadas pelos opioides (para revisão, ver Yaksh et al., 2001), a segunda fase é atenuada por inibidores seletivos da ciclooxigenase. Tal como outras substâncias que actuam no SNC, os extractos foram activos em todas as doses, tanto na fase neurogénica como na fase inflamatória (Figura 16 A e B). Está bem estabelecido que o ácido acético ou a formalina causam dor visceral em animais através da estimulação dos nervos sensoriais primários aferentes e das fibras nervosas C (Collier et al., 1963;
Sua ação simpatolítica nas estruturas espinhais e supraespinhais responsáveis pela modulação dos estímulos dolorosos é conhecida por produzir analgesia eficaz (Mason, 2004; Flores et al., 2012). Estudos demonstram que o óxido nítrico (NO) modula a transmissão sináptica tanto no sistema nervoso central quanto no sistema periférico (Salter et al., 1996; Jain et al., 1999).
Comparação do EAEm e suas frações por HPTLC utilizando
