TÍTULO:
Estudo estrutural e calorimétrico da Importina-α complexada com a sequência de localização nuclear (NLS) da proteína de reparo de DNA NEIL3.
AUTORES:
Ivan Rossi Moraes; Marcos Roberto de Mattos Fontes; Andréa Coelho de Barros.
Campus de Botucatu, Instituto de Biociências, Ciências Biomédicas, ivan.moraes@unesp.br, PIBIC.
INTRODUÇÃO:
A Importina-α (Impα) tem um papel importante na via clássica de importação nuclear, ela realiza o reconhecimento inicial da proteína a ser importada para o núcleo através da sequência de localização nuclear (NLS) presente nessa proteína a ser carregada. Os NLSs melhor caracterizados são descritos como clássicos (cNLS), os quais são constituídos por um ou dois grupos de aminoácidos básicos, denominadas, respectivamente, de sequências monopartidas e bipartidas1. A proteína NEIL3 participa do mecanismo de reparo de DNA por excisão de base (BER) que ocorre no núcleo. Trabalhos prévios com a NEIL3 indicaram uma região rica em resíduos básicos, a qual poderia ser uma sequência NLS monopartida (462PAHKKPKT469)2, portanto, por uma busca por informações sobre como ocorre as interações entre a Impα com as NLSs de proteínas que atuam no reparo de DNA, finalizamos os ensaios estruturais e calorimétricos da Impα de M. musculus (resíduo 70-529) com o peptídeo NLS da proteína NEIL3 (462PAHKKPKT469).
OBJETIVOS:
Esse trabalho tem como objetivo elucidar a interação da Importina-α de mamífero com o peptídeo NLS da proteína de reparo de DNA por excisão de base NEIL3 (462PAHKKPKT469).
MATERIAL E MÉTODOS:
A Impα (70-529) utilizada nos experimentos foi produzida pela expressão da mesma por meio de sistema heterólogo, através de bactérias E. coli. Posteriormente, a amostra foi purificada por cromatografia de afinidade.
Os experimentos calorimétricos foram realizados por calorimetria de titulação isotérmica (ITC) com o microcalorímetro iTC200 (MicroCal – GE Healthcare Life Sciences) configurado com temperatura de 20ºC, agitação de 800 rpm, tempo entre injeções de 240 segundos e injeções de 2 µL. Esse experimento foi realizado em duplicata com a Impα (30 µM) na célula de amostra e com o peptídeo (300 µM) na seringa de injeção.
Para os ensaios estruturais, foram realizados os experimentos de co-cristalização da Impα com o peptídeo da NEIL3 pela a técnica de difusão de vapor por gota suspensa. As condições de cristalização foram compostas por 10mM ditiotreitol (DTT), 0,1M citrato de sódio pH6 e variações de 0,5-0,75M do sal citrato de sódio. Em seguida, foram coletados dados de difração de raios-X no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) de um dos cristais obtidos.
O conjunto de dados resultante foi processado com o programa XDS3, modelado com o programa Coot4 e refinado e analisado/validado com o auxílio do programa Phenix5.
RESULTADOS:
A expressão e a purificação nos forneceram amostra viável de Impα que foi utilizada para os experimentos de calorimetria e cristalização.
Os experimentos de ITC confirmaram a interação da Impα com o peptídeo NLS da proteína NEIL3 com afinidade compatível com complexos similares (Kd de 4,9±1,9 µM)6.
Um conjunto de dados de difração de raios-X do complexo Imp e o peptídeo NLS NEIL3 foi coletado com 2,2Å de resolução e a estrutura foi elucidada. Em seguida, foi observada uma densidade eletrônica correspondente ao peptídeo NLS em estudo no sítio principal da proteína.
DISCUSSÃO:
O resultado nos mostra que a Imp não sofre mudanças conformacionais significativas com a ligação do peptídeo no seu sítio de ligação principal e os resíduos conservados da Impα formam o sítio de ancoramento. De modo geral, a interação do peptídeo NEIL3 com o sítio principal de ligação, apresentam resíduos K, K e K nas regiões de P2, P3 e P5 (462PAHKKPKT469) e se ligam de acordo com o consenso até o momento estabelecido para o reconhecimento dessas sequências. Dessa maneira,os dados estruturais comprovam que o peptídeo NEIL3 é monopartido e interage somente com o sítio principal de ligação da Impα.
REFERÊNCIAS:
1Stewart, M. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007, 195-208.
2Knudsen, N. O., S. D. Andersen, et al. DNA Repair. 2009, 682-689.
3Kabsch, W. Actacrystallographica. Section D, Biological crystallography. 2010, 125-132.
4Emsley, P. and K. Cowtan. Actacrystallographica. Section D, Biological crystallography. 2004, 2126-2132.
5Adams, P. D., et al. Actacrystallographica. Section D, Biological crystallography. 2002, 1948-1954.
6de Barros, A. C., et al.Journal of Molecular Biology. Volume 428, Issue 10, Part A. 2016, 2120-2131.
