1 Campus de Botucatu
MODULAÇÃO DA APRESENTAÇÃO ANTIGÊNICA PELA PRÓPOLIS E POSSÍVEL ATIVAÇÃO DIFERENCIAL DE LINFÓCITOS Th1 E Treg
Candidata: Karina Basso Santiago Supervisor: Prof. Dr. José Maurício Sforcin
Projeto apresentado para solicitação de Pós- Doutorado.
Agosto de 2015
2 RESUMO
A própolis é um produto resinoso, elaborado pelas abelhas a partir de diversas partes das plantas, e se destaca por suas inúmeras propriedades farmacológicas, e pela possibilidade de aplicação na indústria farmacêutica e alimentícia. A maioria dos trabalhos publicados sobre própolis e imunidade foi realizada com animais e poucos são os trabalhos com humanos no tocante à sua ação imunomoduladora. Recentemente, iniciamos estudos com células humanas, avaliando o efeito da própolis em monócitos e células dendríticas e, neste projeto, visamos investigar os mecanismos celulares modulados pela própolis na apresentação de antígenos e ativação diferencial de linfócitos T. Para tal, utilizaremos um antígeno tumoral (MAGE-1) e ácido retinóico e avaliaremos a expressão de receptores celulares (TLR-2, TLR-4, MHC-II, CD80, CD40), ativação de fatores de transcrição (NF-kB e STAT-3) e produção de citocinas (TNF-α, IL-6, IL-10 e IL-12) por monócitos. Também será analisada a proliferação de linfócitos, fatores de transcrição (T-bet e Foxp3) e produção de citocinas (IFN-γ e TGF-β) por linfócitos T, no intuito de investigar se a própolis poderia favorecer um perfil de ativação, culminando preferencialmente na ativação de células Th1 ou T reguladoras (Treg). Assim, partimos do pressuposto de que um determinado evento biológico poderia ser favorecido pela própolis, culminando, por exemplo, na ativação ou supressão da resposta imune celular a tumores. Tais achados serão inéditos e relevantes, pois tal protocolo poderá ser adotado em protocolos antitumorais, evidenciando assim a implicação prática deste projeto de pesquisa.
Palavras-chave: própolis; monócito; linfócito; imunomodulação; produtos naturais
3 1. Introdução
Própolis é um produto resinoso e balsâmico, coletado e elaborado pelas abelhas a partir de algumas partes de plantas como brotos, ramos, cascas de árvores, exsudados resinosos e botões florais, ao qual as abelhas adicionam secreções salivares, cera e pólen (BANKOVA, 2005). As abelhas utilizam a própolis para selar aberturas e controlar variações de temperatura no interior da colméia. A própolis também é utilizada para embalsamar insetos e outros invasores que morrem no interior da colméia, para evitar sua decomposição e manter o ambiente interno asséptico, protegendo-o contra micro-organismos (SALATINO et al., 2005). A própolis tem se destacado devido às suas inúmeras propriedades biológicas e farmacológicas, e pela possibilidade de aplicação na indústria farmacêutica e alimentícia, embora seja utilizada na medicina desde a antiguidade (SALATINO et al., 2005).
Há 20 anos, iniciamos os estudos sobre própolis e desde então, inúmeros trabalhos foram realizados por nosso grupo, visando investigar principalmente suas ações imunomoduladora, antimicrobiana e antitumoral (SFORCIN et al., 2000; MURAD et al., 2002; ORSI et al., 2005;
SFORCIN, 2007; ORSATTI et al., 2010; WATANABE et al., 2011; BÚFALO et al., 2013).
Também verificamos a ausência de efeito colateral após administração de própolis a curto ou longo prazo a ratos (SFORCIN et al., 1995; SFORCIN et al., 2002; MANI et al., 2006).
Décadas atrás, eram escassos os artigos encontrados na literatura pertinente sobre este produto apícola. Nos últimos anos, os pesquisadores demonstraram enorme interesse em investigar sua composição química e propriedades biológicas, havendo considerável avanço no conhecimento científico sobre este apiterápico.
A própolis é composta por 50% de resina, 30% de cera de abelha, 10% de óleos aromáticos e essenciais, 5% de pólen e 5% de outras substâncias variadas, além de impurezas (BURDOCK, 1998). A coloração da própolis pode variar entre amarelo claro, vermelho escuro, verde e até marrom, dependendo da sua origem botânica (SALATINO et al., 2005). Sua composição química é extremamente complexa, variando conforme a localização geográfica e a flora local. As principais fontes de própolis no apiário da UNESP, Campus de Botucatu, são Baccharis dracunculifolia DC (alecrim-do-campo), seguida de Araucaria angustifolia (Bert.) O.
Kuntze e Eucalyptus citriodora Hook (BANKOVA et al., 1999). Os constituintes da própolis como materiais cerosos, bálsamos, óleos essenciais e derivados fenólicos, podem ser extraídos
4 em solventes como etanol, éter, acetona, tolueno e tricloroetileno (CUNHA et al., 2004). Foram identificados mais de 300 componentes presentes na própolis; destes, os principais componentes biologicamente ativos da própolis brasileira são os ácidos diterpênicos e ácidos p-cumáricos prenilados. Há também chalconas, ácido benzóico, benzoaldeído, álcoois, acetona, compostos fenólicos, ácido cinâmico, ácido cafeico e derivados, di- e triterpenos (DE CASTRO, 2001).
Os compostos presentes na própolis produzida no apiário da UNESP, Campus de Botucatu, foram analisados por cromatografia gasosa (GC), cromatografia gasosa associada à espectrometria de massa (GC-MS) e cromatografia em camada delgada (TLC), revelando que seus principais grupos são: compostos fenólicos (flavonóides, ácidos aromáticos, benzopiranos) di- e triterpenos, óleos essenciais, entre outros. Os flavonóides estão presentes em pequenas quantidades (4’-O-metil canferol, 5,6,7-trihidroxi-3,4’dimetoxiflavona, aromadendrina-4’-metil éter); ácido p-cumárico prenilado e dois benzopiranos: E e Z 2,2-dimetil-6-carboxietenil-8- prenil-2H-benzopiranos); óleos essenciais (espatulenol, (2Z, 6E)-farnesol, benzoato de benzila e acetofenonas preniladas); ácidos aromáticos (ácido diidrocinâmico, ácido p-cumárico, ácido ferúlico, ácido cafeico, ácido 3,5-diprenil-p-cumárico, 2,2-dimetil-6-carboxi-etenil-8-prenil-2H- 1-benzo-pirano) (BANKOVA et al., 1998; SFORCIN, 2007). Dados de nosso grupo evidenciaram que variações sazonais na composição da própolis não são significativas, havendo concentrações dos compostos biologicamente ativos em todas as estações do ano (BOUDOUROVA-KRASTEVA et al., 1997; SFORCIN, 2007).
Com relação ao sistema imunológico, a própolis modula os eventos iniciais da resposta imune em camundongos, induzindo a expressão de Toll-like receptor (TLR)-2 e TLR-4 e produção de citocinas pró-inflamatórias (ORSATTI et al., 2010), bem como a geração de espécies reativas do oxigênio (H2O2) por macrófagos peritoneais (ORSI et al., 2000). A própolis também induz aumento na atividade fungicida de macrófagos contra Paracoccidioides brasiliensis (MURAD et al., 2002) e na atividade bactericida contra Samonella Typhimurium, envolvendo a participação de intermediários reativos do oxigênio e do nitrogênio (ORSI et al., 2005). Entretanto, a maioria dos trabalhos publicados sobre própolis e imunidade foi realizada com animais e, mais recentemente, iniciamos os estudos com monócitos e células dendríticas humanos (BÚFALO et al., 2014; CONTI et al., 2013).
Monócitos/macrófagos são células do sistema fagocítico mononuclear, sendo de fundamental importância na imunidade inata do hospedeiro. Monócitos podem ser distinguidos
5 dos macrófagos por vários critérios, além de sua localização, por estarem no sangue, enquanto macrófagos estão nos tecidos. Monócitos possuem citoplasma e núcleo menores, maior conteúdo de mieloperoxidase e níveis menores de esterases não específicas. Funcionalmente, são menos aderentes e possuem atividade fagocitária menor. Expressam menor número de antígenos de histocompatibilidade de classe II e de receptores para porção Fc de imunoglobulinas ou para o componente C3 do sistema complemento. No entanto, as diferenças entre monócitos e macrófagos são mais quantitativas do que qualitativas, sendo comumente difícil a diferenciação entre as duas células (WILTROUT & VARESIO, 1991).
O reconhecimento de antígenos através de receptores celulares, seu processamento e apresentação são eventos críticos para o desencadeamento de uma resposta imunológica, e os fagócitos elaboram respostas aos seus alvos de acordo com seu microambiente e presença de determinadas citocinas (DJALDETTI et al., 2002; FREEMAN & GRISTEIN, 2014).
Os TLRs reconhecem micro-organismos através da detecção de produtos ou estruturas microbianas conservadas, denominados de padrões moleculares patógeno-associados (PAMPs).
Os PAMPs estão ausentes em células eucarióticas, mas podem estar presentes tanto em micro- organismos patogênicos ou não, fazendo com que os TLRs sejam capazes de distinguir o próprio do não-próprio (MEDZHITOV, 2001). TLRs reconhecem um diverso, porém limitado, número de PAMPs. Como exemplo, TLR-2 reconhece uma grande quantidade de produtos microbianos, como peptidioglicanos, lipopolissacarídeos (LPS) de bactérias Gram-negativas, lipoproteínas, componentes de parede celular de micobactérias, dentre outros. Tal variedade de ligantes pode ser explicada, em parte, pela cooperação existente entre TLR-2 e TLR-1 ou TLR-2 e TLR-6, ocorrendo formação de heterodímeros. Já TLR-4 tem como agonistas LPS de bactérias Gram- negativas, ácido lipoteicóico e a proteína de fusão F do vírus respiratório sincicial (RSV). Ácidos nucléicos virais ou bacterianos são reconhecidos por TLR-3/7/8 e 9 enquanto o TLR-5 tem como ligante a flagenina bacteriana (TAKEDA & AKIRA, 2005).
Após reconhecimento de micro-organismos, há ativação de vias de transdução de sinal, ativação de vários fatores de transcrição, como, por exemplo, NF-kB e STAT-3, relacionados à expressão gênica de TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-10. A via de sinalização do NF-kB é tipicamente pró-inflamatória, podendo ser ativada por inúmeros estímulos intra- ou extracelulares e levando à produção de citocinas como TNF-α e IL-1β.
6 A IL-6 pode ser regulada por múltiplos fatores de transcrição, incluindo NF-kB e AP-1 (HUNGNESS et al., 2000). Embora a IL-10 ative STAT-3, evidências revelam que a produção desta citocina pode ser controlada por STAT-3 (STAPLES et al., 2007). Estudos recentes demonstraram que a via STAT pode ser um alvo no controle da tumorigênese, incluindo linfomas e leucemias, embora os mecanismos de ação ainda apresentem falhas e sucessos quanto à inibição de STAT-3 (MUNOZ et al., 2014). Individualmente ou em combinação, as citocinas interagem com seus receptores específicos, modulando a função celular. Citocinas como o TNF- são importantes no processo de ativação de monócitos e macrófagos, enquanto que outras citocinas, como a IL-10, são consideradas fatores de desativação celular. Durante a inflamação, há níveis elevados de TNF- e IL-1, os quais também atuam como pirógenos endógenos. A IL-6 está envolvida não somente na resposta imunológica, apresentando ações pró- e anti-inflamatórias, como também em processos regenerativos, na regulação do metabolismo, na manutenção óssea e funções neurais (SCHELLER et al., 2011). A IL-12 é uma citocina com importante função no início e regulação da resposta imune celular, e possui capacidade de promover a diferenciação de células T naïve em Th1 produtoras de IFN-γ, as quais são fundamentais para o desenvolvimento da imunidade celular e resistência contra patógenos intracelulares.
Os ativadores de transcrição induzem também a expressão de genes envolvidos na resposta imune do organismo, como quimiocinas, moléculas de histocompatibilidade (MHC), moléculas co-estimulatórias importantes para ativação das células T, como CD80 (B7-1) que se liga ao CD28, e CD40, a qual atua como uma molécula transmembrânica sinalizadora, levando à ativação de fatores de transcrição, regulando um amplo espectro de processos moleculares e celulares, incluindo o início e progressão das respostas adaptativas celular e humoral (MEDZHITOV, 2001; HAN et al., 2003).
Monócitos apresentam antígenos aos linfócitos T via MHC (I ou II), fornecendo o primeiro sinal para ativação dos linfócitos T, e também expressam moléculas co-estimulatórias (B7-1, B7-2), propiciando o segundo sinal para ativação destas células, além de secretarem citocinas que determinam o perfil de linfócito efetor gerado após a ativação. Há várias subpopulações de linfócitos descritas, que podem ser classificadas pelos fatores de transcrição envolvidos e perfil de citocinas que produzem após ativação para exercerem suas funções efetoras (perfis Th1, Th2, Th17, Treg, entre outras).
7 Recentemente, HELMSTETTER et al. (2015) relataram que a expressão probabilística de citocinas por células Th diferenciadas ainda não está completamente elucidada. O perfil Th1 é caracterizado pela diferenciação de linfócitos T naïves na presença de IL-12 com ativação dos fatores de transcrição T-bet, STAT-1 e STAT-4, promovendo a produção de IFN-γ. O IFN-γ ativa STAT-1, que por sua vez induz a ativação de T-bet - o regulador da diferenciação do perfil Th1. A IL-12 ativa STAT-4 e amplifica o sinal de ativação. As células Th1 produzem citocinas que estimulam a produção de moléculas microbicidas (como espécies reativas do oxigênio, óxido nítrico, peroxinitritos) por macrófagos ativados, aumentando a atividade fagocítica e a destruição dos patógenos endocitados. A produção de IFN-γ também potencializa o processo inflamatório, pois estimula a produção de citocinas pró-inflamatórias (como TNF/IL-1), quimiocinas, mediadores lipídicos da inflamação (PAF, leucotrienos, prostaglandinas) e a migração de neutrófilos e outros leucócitos para o local da infecção, e seu principal papel é a proteção contra micro-organismos intracelulares, células tumorais, entre outros.
Já as células T reguladoras (Tregs) representam uma subpopulação de linfócitos T caracterizados pela expressão da molécula CD25+ e do fator nuclear Foxp3. A aceitação das células Tregs como uma linhagem distinta foi devida principalmente à identificação deste fator de transcrição, mas ainda permanece obscuro como os timócitos são selecionados nessa linhagem alternativa de células Tregs (FEUERER et al., 2009). Alguns estudos demonstraram que as células Tregs têm capacidade de suprimir a resposta imune celular a tumores.
Especificamente, Tregs têm sido responsáveis pela inibição da proliferação e produção de citocinas por células Th1 (CHAPUT, 2007; VAN der BURG et al., 2007). Células Tregs induzem a supressão das células T efetoras pela ação de TGF-β e IL-10, bloqueando a ativação e a função destes linfócitos, sendo importantes no controle da resposta imunológica a antígenos próprios e não-próprios. TGF-β exerce função supressora sobre as células alvo, enquanto a IL-10 inibe a ativação das células apresentadoras de antígeno e é antagonista do IFN-γ, sendo relacionada às reações de controle da inflamação nos tecidos alvo (BENOIST & MATHIS, 2012).
Tregs exercem papel importante em doenças infecciosas e em tumores. Para o controle das respostas imunológicas a infecção, diversos mecanismos são acionados e as Tregs participam ativamente no controle destas respostas. Em pacientes infectados por HIV, a progressão da doença está diretamente relacionada a um estado de hiperativação imune, e nestes casos há uma
8 redução no número e na função das Tregs. Já os trabalhos sobre Tregs em neoplasias malignas sugerem que o aumento na atividade destas células associa-se a uma resposta prejudicada na imunidade anti-tumoral. A expressão do Foxp3 está sendo usualmente correlacionada com um curso desfavorável de neoplasias (ZHENG & RUDENSKY, 2007). Assim, como estratégia terapêutica para o tratamento do câncer, a inibição da função das Tregs pode ter resultados positivos (MELO & CARVALHO, 2009).
Transcriptome shotgun sequencing (RNA-seq) é uma metodologia moderna baseada em análises de seqüenciamento de alto rendimento do RNA, permitindo a contagem sistemática de todos os transcritos do gene. Sua análise é fundamental para o conhecimento dos constituintes moleculares de células e tecidos, e interpretação dos elementos funcionais do genoma. A metodologia de RNA-seq pode ainda fornecer informações adicionais quanto à complexidade do genoma em questão, assim como um grande espectro de RNAs não codificadores. Outra vantagem é a maior sensibilidade e identificação de genes ainda desconhecidos (WOLF, 2013).
Diante destas observações, o presente projeto foi delineado visando avaliar a ação moduladora da própolis nos mecanismos envolvidos na apresentação de antígenos e possível ativação diferencial de linfócitos T humanos. Para tal, utilizaremos um antígeno tumoral (human MAGE-1) identificado em melanoma e outros tipos de tumores e alvo para imunoterapia de câncer (BÜELER & MULLIGAN, 1996; LU et al., 2014) e o ácido retinóico (metabólito da vitamina A, que impede a conversão das células Tregs em Th1 ou Th17 e mantém a expressão de Foxp3) no intuito de investigar se a propolis poderia favorecer um perfil de ativação, culminando preferencialmente no perfil Th1 ou Treg, analisando a produção de citocinas e expressão de fatores de transcrição por RNA-seq.
Assim, partimos do pressuposto de que a apresentação antigênica e ativação de linfócitos T poderiam ser moduladas pela própolis, culminando, por exemplo, na resposta imune celular a tumores, ou reguladora, em função do perfil de linfócitos T gerado (Th1 ou Treg). Tais achados serão inéditos e relevantes, pois tal protocolo poderá ser adotado em protocolos antitumorais, evidenciando assim a implicação prática deste projeto de pesquisa.
2. Justificativa do projeto e resultados esperados
Com base nos dados expostos e na ausência de informações sobre o papel da própolis na modulação antigênica e na diferenciação de linfócitos T humanos, este projeto foi elaborado
9 visando dar continuidade aos achados prévios junto à nossa linha de pesquisa. Este projeto foi discutido em janeiro de 2015 com a Profa. Dra. Maria Teresa Cruz, da Universidade de Coimbra, Portugal, amadurecendo as ideias iniciais e propondo objetivos inéditos, pois a realização deste projeto trará importantes contribuições não só em relação à ação imunomoduladora da própolis, como também poderá trazer inovação quanto à sua ação adjuvante na terapia antitumoral ou na regulação da resposta inflamatória, o que pode ser de interesse para a indústria farmacêutica futuramente. A formação prévia da candidata auxiliará a alavancar nossa linha de pesquisa, utilizando metodologias modernas e que responderão inúmeros questionamentos nesta área.
Ademais, a realização deste projeto será articulada com outros projetos de pesquisa do grupo em andamento, incluindo uma iniciação científica, um mestrado e outro pós-doutorado.
3. Objetivos
Verificar o possível efeito citotóxico da própolis e dos antígenos sobre monócitos de indivíduos saudáveis;
Analisar a ação da própolis simultaneamente ou não com os antígenos sobre a expressão de marcadores de superfície celular (TLR-2, TLR-4, MHC-II, CD80, CD40) em monócitos, por citometria de fluxo;
Realizar a análise de expressão diferencial de RNAm pela técnica de RNA-seq (transcriptoma) após o tratamento de monócitos dando ênfase às vias de ativação NF- kB e STAT-3;
Avaliar a produção de citocinas pró- e anti-inflamatórias (TNF-, IL-6, IL-10 e IL- 12), por ensaio imunoenzimático (ELISA);
Avaliar a proliferação de linfócitos após co-cultura com monócitos tratados com própolis simultaneamente ou não com os antígenos;
Avaliar a fenotipagem (Th1 e Treg) dos linfócitos T através da expressão dos fatores de transcrição T-bet e Foxp3 por RNA-seq;
Analisar o perfil de citocinas (IFN-γ e TGF-β) produzidas por linfócitos T por citometria de fluxo.
10 4. Desafios científicos e tecnológicos e os meios e métodos para superá-los
Este projeto já foi submetido para apreciação pelo Comitê de Ética em Pesquisa, da Faculdade de Medicina, UNESP, Campus de Botucatu. Os desafios científicos e tecnológicos poderão ser superados através da metodologia proposta, delineada com base na literatura pertinente e com protocolos que responderão nossas indagações.
4.1. Obtenção da amostra de própolis e antígenos
A própolis será produzida por abelhas africanizadas (Apis mellifera L.), no apiário da Fazenda Experimental Lageado, (UNESP, Campus de Botucatu). As amostras serão obtidas em telas propolisadoras congeladas para facilitar a remoção da própolis. Em seguida, a própolis será triturada e extraída (30 g de própolis para 100 mL de etanol 70%), em ausência de luz e sob moderada agitação. Após 7 dias, os extratos serão filtrados e será calculada a concentração final, para obter o peso seco da solução (mg/mL) (SFORCIN et al., 2005).
A própolis será diluída em meio RPMI completo (Cultilab, Brasil), contendo 0,1 g/L de L- glutamina, 2,2 g/L de bicarbonato de sódio, 10 mL/L de aminoácidos não essenciais e suplementado com 10% de soro fetal bovino (Cultilab, Brasil). Após filtração, serão realizadas diluições para se obter as concentrações de 5 e 25 g/mL de própolis, plaqueando o volume final de 500 µL na placa de 24 poços. Os mesmos procedimentos serão realizados com o álcool 70%
(solvente da própolis) para se obter 0,03 e 0,15% de álcool (volumes correspondentes ao teor de álcool 70% nas concentrações de 5 e 25 g/mL de própolis, respectivamente) (BÚFALO et al., 2009).
Os antígenos (human MAGE-1 e ácido retinóico) serão adquiridos da Sigma-Aldrich (EUA) e as concentrações a serem utilizadas serão padronizadas em experimentos-piloto.
4.2. Obtenção de monócitos humanos
O sangue será obtido de 10 indivíduos voluntários saudáveis, que assinarão um termo de consentimento para retirada de sangue, dando ciência desta pesquisa. Serão aceitos indivíduos acima de 18 anos, não fumantes e que não estejam doentes e nem utilizando medicação de espécie alguma. Tais indivíduos serão informados desta pesquisa através de cartazes afixados nos murais do Instituto de Biociências, e participarão desta pesquisa somente aqueles que tiverem interesse por livre e espontânea vontade.
11 Amostras de sangue (20 mL) serão coletadas e colocadas em tubos estéreis contendo 200 µL de heparina. Posteriormente, os monócitos serão obtidos por separação em gradiente de Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Suécia) através de centrifugação e o anel rico em células mononucleares será coletado e lavado 2 vezes em meio RPMI por 10 minutos a 200 x g. Em seguida, o sobrenadante será desprezado e o pellet de células ressuspendido em 1 mL de RPMI completo. A identificação e viabilidade dos monócitos serão realizadas através da incorporação de vermelho neutro a 0,02% durante 8 minutos a 37ºC. Após contagem em câmara de Neubauer, a concentração celular será ajustada para 1 x 106 células/mL, e 500 L serão adicionados em cada poço da placa de cultura celular de 24 wells, incubando a 37ºC e 5% de CO2 por 1h30 para aderência dos monócitos. Após este período, o sobrenadante será coletado para posterior cultura de linfócitos, e as células aderentes serão incubadas com própolis, simultaneamente ou não com MAGE-1 e acido retinóico por 24 h.
Em nosso Departamento, realizamos de tempos em tempos o teste para esterase não- específica para determinar a quantidade de monócitos presentes entre as células aderentes, além da análise morfológica. Dessa maneira, podemos afirmar que mais de 90% das células aderentes são monócitos (BANNWART et al., 2010).
4.3. Viabilidade de monócitos após incubação com própolis
Quinhentos microlitros contendo 5 x 105 células serão adicionados em cada poço da placa, incubando-se a 37°C sob pressão constante de 5% de CO2 por 24 h, na presença da própolis, simultaneamente ou não com os antígenos. Células controle serão incubadas somente com meio de cultura. A viabilidade celular será analisada através do método de redução pelo MTT {brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio]} (Sigma-Aldrich, EUA). Após o período de incubação, retira-se o sobrenadante da cultura e adiciona-se 300 µL do MTT na concentração de 1 mg/mL em meio RPMI completo, incubando novamente as células por mais 3 h. Após a incubação, o sobrenadante será retirado cuidadosamente e adiciona-se 200 µL de dimetilsulfóxido. Em seguida, este volume será transferido para placas de 96 wells e a absorbância correspondente a cada amostra será obtida em leitor de ELISA, utilizando-se o filtro de 540 nm (NAJAFI et al., 2007). A absorbância obtida das células controle (não tratadas) será considerada como 100% de viabilidade celular.
12 4.4. Cultura de monócitos para avaliação de marcadores de superfície, vias de sinalização e dosagem das citocinas
As culturas de monócitos, contendo 1 x 106 células/mL, serão incubadas com as concentrações de própolis que não apresentarem citotoxicidade e com os antígenos. Após 24 h, os sobrenadantes serão coletados e armazenados a –70ºC para posterior dosagem de citocinas, e as células serão utilizadas para avaliação dos marcadores de superfície e vias de sinalização.
4.4.1. Avaliação de marcadores de superfície celular por citometria de fluxo
Nos ensaios de citometria de fluxo, utilizaremos o citômetro de fluxo modelo FACS CaliburTM (BD Becton Dickinson and Company, EUA).
Para avaliação da presença dos seguintes marcadores celulares: TLR-4, TLR-2, HLA-DR, CD80 e CD40, as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) contendo 5 x 105 monócitos/500 L serão colocadas em tubos Falcon de poliestireno para citômetro e centrifugadas por 10 minutos a 1700 rpm. O sobrenadante será descartado e as culturas serão incubadas por 24 horas a 37ºC com a própolis simultaneamente ou não com os antígenos. Em seguida, as células serão lavadas, ressuspendidas em 1 mL de solução eletrolítica (ISOTON II) e incubadas com os anticorpos monoclonais fluoresceinados específicos. As células serão separadas em dois grupos (A e B). No grupo A, as células estimuladas serão incubadas com 5 µL dos anticorpos anti-TLR-2 conjugado com FITC (clone TL2.1 - Biolegend, EUA) e anti-TLR-4 conjugado com PE (clone HTA125 - Biolegend, EUA). No grupo B, os monócitos serão incubados com 5 µL dos anticorpos anti-HLA-DR conjugado com FITC (clone L243 - Biolegend, EUA), anti-CD80 conjugado com PE (clone D210 - Biolegend, EUA) e anti-CD40 conjugado com APC (clone 5C3 - Biolegend, EUA). Para cada teste, será incluído um tubo controle onde as células serão incubadas com 5 µL dos anticorpos de controle isotípico marcados com os respectivos fluorocromos dos testes (PE, FITC, PerCP/Cy5.5 e APC – Biolegend, EUA) durante 30 minutos ao abrigo da luz à 4ºC. As células serão marcadas com 5 µL anti-CD14 conjugado com PerCP/Cy5.5 (clone HCD14 - Biolegend, EUA), o que permitirá a seleção do gate apenas dos monócitos CD14+. Após a incubação, as células serão centrifugadas por 10 minutos a 1700 rpm para lavagem, fixadas em 450 L de ISOTON II contendo 50 L de paraformaldeído 5% e analisadas por citometria de fluxo (NAKAIRA-TAKAHAGI et al., 2011).
13 As análises serão realizadas utilizando o software CellQuest para adquirir e analisar multiparâmetros celulares. Será padronizada a aquisição de 30.000 eventos (no gate) por amostra e será otimizada a população de interesse estabelecendo gate com base em parâmetros de tamanho (FSC) e granulosidade (SSC). Os resultados serão expressos em percentual de células CD14 positivas. (NAKAIRA-TAKAHAGI et al., 2011).
4.4.2. Expressão diferencial de RNAm envolvidos na via de sinalização do NF-kB e STAT-3 em monócitos por RNA-seq (transcriptoma)
O RNA total será extraído de cada amostra com o kit Total RNA Purification (Norgen Biotek Corp.®), seguindo as instruções do fabricante. Com o objetivo de eliminar o DNA residual genômico extraído junto com o RNA, as células serão lisadas com solução de lise acrescida da enzima DNAse livre de RNAse, que acompanha o kit, na proporção 1:100. Em seguida apenas os RNAm serão separados, utilizando o kit NEBNext® Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module. O material obtido será congelado a -80°C para obtenção do cDNA por meio de ensaio de Transcrição Reversa.
Para o preparo da fita dupla do DNA a partir do RNA e análise do transcriptoma do NGS (next generation sequency), o RNAm purificado servirá de molde para a confecção de cDNA, pela transcrição reversa com a enzima Improm II (Promega®) de acordo com as recomendações do fabricante e utilizando iniciadores randômicos (randon hexamer). Em seguida, será realizada a reação para transcrição da segunda fita utilizando a RNAse H, T4 DNA polimerase e T4 ligase conforme recomendações de SAMBROOK & RUSSEL (2001). O DNA de dupla fita gerado a partir das amostras poderá ser congelado à -20°C para posterior avaliação do transcriptoma. O cDNA de dupla fita obtido será utilizado nos kits de seqüenciamento Nextera XT e Nextera Index (que identifica cada amostra) que são recomendados para preparo das amostras para serem submetidas ao seqüenciador Illumina NexSeq utilizando a flowCell de 50 ciclos (DILLIES et al., 2012). Após obtenção dos dados, as seqüências, denominadas "reads" serão montadas com base em seqüências de cada um dos transcritos de interesse utilizando o programa CLC genomics. O número de "reads" será normalizado pelo numero total de "reads" da amostra respectiva e pelo tamanho do transcrito de interesse. Esse valor, denominado de RPKM ("reads or fragments per kilobase exon per million reads") será utilizado para comparação da expressão entre as diferentes amostras testadas. Só serão consideradas para análise as amostras com mais de 10 milhões de
14 reads. Alternativamente, essa análise será realizada utilizando os kits de análise de expressão diferencial fornecidos pela empresa Illumina. Esses kits, denominados "target RNA sequencing"
juntamente com os equipamentos de seqüenciamento massivo, realizam análise de expressão diferencial onde o usuário escolhe os RNAm a serem analisados. Assim, é possível direcionar a análise para alvos específicos e para maior número de amostras além dos alvos propostos, otimizando assim a obtenção de resultados interessantes em nosso projeto.
4.4.3. Determinação de citocinas pela técnica de ELISA
A determinação da concentração de TNF-α, IL-6, IL-10 e IL-12 será realizada através de ensaio imunoenzimático (ELISA). Inicialmente serão adicionados 100 µL de salina tamponada com fosfato (PBS) e anticorpos monoclonais diluídos conforme instruções do fabricante (R & D Systems, EUA) às placas de poliestireno (Maxisorp-Nunc, EUA), e incubadas overnight a 4ºC em câmera úmida. Após 3 lavagens dos poços com PBS acrescido de Tween 20 (0,05%), ocorrerá o bloqueio dos poços com albumina sérica bovina (Sigma-Aldrich, EUA) em PBS (10%) para saturação dos sítios de ligação e, em seguida, a placa será incubada a temperatura ambiente por 1h. A seguir, nova seqüência de lavagens será realizada e alíquotas de 100 µL dos sobrenadantes das culturas de células serão adicionadas com posterior incubação por 2 h a temperatura ambiente. Os poços serão novamente lavados e, ao anticorpo de detecção policlonal biotinilado, será adicionado o conjugado estreptoavidina-peroxidase, incubando-se novamente por 20 min. Novas lavagens serão realizadas e, para revelação, serão adicionados 100 µL da solução contendo o substrato peróxido de hidrogênio e tetrametilbenzidina. Após 20 minutos a temperatura ambiente, a reação enzimática será interrompida pela adição de 50 µL de H2SO4 2N.
As leituras serão realizadas em leitor de ELISA com filtro de 490 nm.
4.5. Obtenção de linfócitos e co-cultura com monócitos
Células mononucleares do sangue periférico serão obtidas por meio da separação em gradiente de Ficoll-Paque Plus com centrifugação a 1500 rpm por 30 minutos. O anel rico em células mononucleares será coletado e tratado com tampão de lise para hemácias por 5 minutos em temperatura ambiente. Após este período, a suspensão celular será lavada por 2 vezes com meio de cultura RPMI 1640 por 10 minutos a 1500 rpm, para total remoção das plaquetas. Em seguida, os monócitos (CD14+) serão isolados pela técnica de seleção magnética (“MACS:
15 magnetic-activated cell sorting”) positiva na qual essas células se ligarão a anticorpos monoclonais anti-CD14 acoplados a microesferas (Human CD14 Microbeads, kit - Miltenyi Biotec Inc, EUA). Inicialmente, as células serão ressuspendidas em tampão de separação (MACS buffer: solução de PBS com 0,5% de albumina sérica bovina e 2 mM de EDTA) e a concentração celular ajustada para 1x107 células/mL, após contagem e a identificação por meio de coloração com solução de Turk. Após centrifugação a 1500 rpm por 10 minutos, o sobrenadante será descartado e para cada 1x107 células será adicionado 80 μL de MACS buffer e 20 μL de anti-CD14 ligado à microesferas, seguido por incubação por 15 minutos à 4°C. Em seguida, serão adicionados 2 mL do MACS buffer para cada 1x107 células seguido de centrifugação a 300g por 10 minutos para remoção de microesferas que não se ligaram às células. Em seguida, o sobrenadante será removido e para cada 1x107 células serão acrescidos 500 μL de MACS buffer. Essa suspensão será aplicada em coluna magnética modelo MS acoplada à plataforma MACS. As células marcadas com as microesferas serão retidas na coluna enquanto que as não marcadas serão coletadas para posterior separação das células CD4+. As células CD14+ serão recuperadas em tubo após a remoção da coluna da plataforma e subsequente lavagem desta com o tampão. A contagem das células viáveis será realizada por meio da coloração com solução de azul Tripan.
4.5.1. Isolamento das células T CD4+
O isolamento das células CD4+ será realizado pela técnica de separação magnética negativa. As células serão incubadas com anticorpos monoclonais acoplados a esferas magnéticas contidas no kit comercial: MACS® CD4+T Cell Isolation Kit II (Miltenyi Biotec Inc, EUA). Esses kits contêm coquetéis de anticorpos biotinilados que se ligam especificamente às suas moléculas alvo; no entanto, o coquetel para isolamento de células TCD4+, não contém anticorpos contra essa molécula, por esta razão, os linfócitos TCD4+ tendem a não ser marcados por estes anticorpos biotinilados. Esta interação anticorpo-biotina permite que as células marcadas sejam retidas quando submetidas ao campo magnético da plataforma. Logo, as células CD4+ não retidas à coluna serão coletadas em tubos que acompanham o kit e submetidas aos ensaios propostos.
16 4.5.2. Incubação dos monócitos com células T CD4+
Monócitos estimulados com antígenos simultaneamente ou não com a própolis por 24h serão incubados com linfócitos T CD4+ obtidos do mesmo indivíduo, na proporção monócito:linfócito de 1:10 por 72 h. Após esse período, será avaliada a linfoproliferação, o fenótipo Th1 ou Treg através da produção de citocinas intracitoplasmáticas IFN- e TGF-β por citometria de fluxo, e a expressão de fatores de transcrição envolvidos nas diferentes subpopulações de linfócitos T como T-bet (Th1) e Foxp3 (Treg) por RNA-seq, como descrito a seguir.
4.6. Proliferação de células T CD4+
O ensaio de proliferação de linfócitos será realizado através da marcação com CFSE, utilizando o kit CellTrace™ Cell Proliferation (Life Technologies, EUA), seguindo as instruções do fabricante. As células serão ressuspendidas em PBS/BSA 0.5%, ajustando a concentração celular para 1x107 linfócitos/mL. Será adicionado 1µL de CFSE em 1 mL de amostra, incubando a 37°C ao abrigo da luz. Após 10 min, a amostra será diluída 5x em meio RPMI completo. Após incubação em gelo por 5 min, o material será centrifugado a 800g por 7min e lavado 2x com meio de cultura gelado. Após a marcação, os linfócitos serão utilizados nos ensaios de co-cultura e após 72 h a proliferação será analisada em citômetro de fluxo com fonte de excitação de 488 nm, utilizando 10.000 eventos. Para análise dos resultados, será utilizado o software Flowjo (Tree Star).
4.7. Imunofenotipagem das células TCD4+ e produção de citocinas
As células CD4+ submetidas aos diferentes protocolos serão avaliadas quanto ao seu fenótipo, por meio da expressão da molécula de superfície CD4+ e detecção intracitoplasmática das diferentes citocinas. Nos experimentos de identificação das subpopulações Th1 e Treg, seis horas antes do término das co-culturas as células serão tratadas com brefeldina A (BFA) para impedir a liberação das citocinas do citoplasma celular. As células CD4+ serão transferidas para os tubos de citometria em solução de ISOTON II e centrifugadas a 1700 rpm por 10 minutos. O sobrenadante será desprezado e 100L de solução A do kit Fix & Perm serão adicionados (ADG Bio Research, Áustria), incubando-se por 15 minutos. Em seguida, será adicionada solução de ISOTON II, centrifugando a 1300 rpm por 5 minutos e, após remoção do sobrenadante, serão
17 adicionados 100L de solução B do kit Fix & Perm na presença dos anticorpos intracelulares anti-IFN- conjugado com FITC (clone B27 - Biolegend, EUA) e anti-TGF-β conjugado com FITC (clone TW4-2F8 - Biolegend, EUA). Para cada teste, será incluído um tubo controle onde as células serão incubadas com anticorpos de controle isotípico marcados com os respectivos fluorocromos dos testes (FITC, PerCP/Cy5.5 e APC – Biolegend, EUA) durante 30 minutos ao abrigo da luz à 4ºC. As células serão marcadas com anti-CD4 conjugado com PerCP/Cy5.5 (clone OKT4 - Biolegend, EUA), e para Treg com anti-CD25 conjugado com APC (clone M- A251 - Biolegend, EUA) o que permitirá a seleção do “gate” apenas dos linfócitos CD4+. Após a incubação, as células serão centrifugadas por 10 minutos a 1700 rpm para lavagem, fixadas em 450 L de ISOTON II contendo 50 L de paraformaldeído 5% e analisadas por citometria de fluxo.
4.8. Avaliação da expressão de fatores de transcrição de linfócitos (T-bet e Foxp3) por RNA-seq
Esta avaliação será realizada conforme descrito anteriormente em 4.4.2.
4.9. Análise estatística
A análise dos dados será realizada através do software Graph Pad Prism 5 (GraphPad San Diego, CA, USA) utilizando-se a Análise de Variância (ANOVA) para medidas repetidas, seguida do teste de comparações múltiplas de Dunnett (p<0,05).
5. Cronograma
2º semestre de 2015:
Setembro: Padronização da metodologia proposta em relação aos monócitos, e avaliação da possível ação citotóxica das variáveis estudadas sobre monócitos de indivíduos saudáveis;
Outubro/Novembro/Dezembro: Avaliação da expressão de marcadores de superfície celular (TLR-2, TLR-4, MHC-II, CD80, CD40) em monócitos, por citometria de fluxo.
18 1º semestre de 2016:
Janeiro/Fevereiro: Avaliação da produçãode citocinas pró- e anti-inflamatórias (TNF-α, IL-6, IL-10 e IL-12) por monócitos, através de ensaio imunoenzimático (ELISA);
Março/Abril/Maio: Avaliação das vias de ativação NF-kB e STAT-3 pela técnica de RNA-seq (transcriptoma);
Junho/Julho: Padronização das co-culturas monócitos + linfócitos coletados do mesmo doador.
2º semestre de 2016:
Agosto/Setembro: Ensaios de proliferação de linfócitos após co-cultura com monócitos tratados com própolis simultaneamente ou não com os antígenos;
Outubro/ Novembro/Dezembro: Analise do perfil de citocinas (IFN-γ e TGF-β) produzidas por linfócitos T por citometria de fluxo.
1º semestre de 2017:
Janeiro/Fevereiro/Março: Avaliação da fenotipagem (Th1 e Treg) dos linfócitos T através da expressão dos fatores de transcrição T-bet e Foxp3 por RNA-seq;
Abril/Maio: Realização dos experimentos finais e análise dos resultados.
Junho/Julho: Análise final dos resultados, elaboração do relatório final e redação do manuscrito a ser submetido à publicação.
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