No entanto, a remoção de um enxerto autógeno representa muitas vezes um risco significativo de morbilidade e complicações pós-operatórias, associado a elevados custos financeiros (Nyberg et al., 2017). Dentre os enxertos xenogênicos mais aceitos na clínica estão os enxertos de hidroxiapatita (HA) de origem bovina, que demonstram alta capacidade de osteocondutividade e têm sido amplamente estudados (Lee et al., 2017). Uma característica positiva do β-TCP é a promoção de uma fase estável entre o HA e o tricalciofosfato, o que possibilita a liberação lenta de íons cálcio e fosfato que afetam a remodelação óssea (Hivernaud et al., 2019).
A nanotecnologia potencializa as propriedades bioativas do AH em associação com seus cristais, resultando em uma melhor resposta em associação com nanocristais do que com cristais mais espessos, permitindo a construção de uma estrutura semelhante a uma matriz extracelular que favorece o ROG (Wang et al., 2017). ). A associação de hidroxiapatita (80%) com β-TCP (20%) tem se apresentado como uma formulação eficaz para promover a regeneração óssea guiada utilizando o primeiro elemento como plataforma inicial e liberação lenta de íons cálcio e fosfato. processo de regeneração (De Oliveira Puttini et al., 2019). Neste trabalho, a combinação de AH (78,76%) com β-TCP (21,03%) e óxido de cálcio (0,19%) do produto comercial Blue Bone e a estrutura das nanopartículas (Figura 1) é avaliada como uma formulação eficaz para promover ROG (Da Silva Brum et al., 2019), que modula a bioreabsorção de material no corpo.
A degradação do β-TCP desempenha um papel importante nas características dos biomateriais (Ishikawa et al., 2018).
REVISÃO DE LITERATURA
Após a mineralização da vesícula da matriz, esse processo se estende às fibrilas de colágeno e às regiões interfibrilares (Mebarek et al., 2013). A hidroxiapatita pode ser mostrada como marcador para avaliar a diferenciação osteogênica de células-tronco mesenquimais (Tsao et al., 2017). Em seguida, ocorre a fase de inflamação, com liberação de citocinas e recrutamento de células progenitoras através de mediadores (Ho-Shui-Ling et al., 2018).
Os enxertos podem ser utilizados isoladamente ou associados a moléculas e células (Ho-Shui-Ling et al., 2018). Os biomateriais podem ser classificados de diversas maneiras: pela sua escala de tamanho (nanométrica ≤ 100nm, submícron 100-1μm e micrométrica ≥ 1 μm), pela sua origem (autógena, proveniente do próprio organismo, alogênica, originária de um organismo da mesma espécie ou propriedades semelhantes, xenogênicas, originárias de espécies diferentes e aloplásticas, de origem sintética), devido à sua resposta ao organismo (bioinerte, bioativa e bioabsorvível) (Jeong et al., 2019; Zhu; Luo; Liu, 2020). Pode ser expressa como a capacidade do biomaterial de não produzir reação negativa em um organismo vivo (Iaquinta et al., 2019).
No entanto, poros maiores que 100 μm afetam a resistência mecânica, enfraquecendo o biomaterial que pode não resistir ao impacto (Jeong et al., 2019). A hidroxiapatita, além da biocompatibilidade, possui resistência à compressão e corrosão (Iaquinta et al., 2019), além de notável capacidade de adsorver moléculas. Posteriormente, ocorre a deposição de fosfato de cálcio amorfo no biomaterial devido à solubilidade do material, o que promove a calcificação tecidual (Da Silva Brum et al., 2019).
A temperatura de sinterização altera as propriedades dos materiais, modificando a resposta à deposição óssea (Carolina et al., 2019). Através da Regeneração Óssea Dirigida, o objetivo é restaurar a estrutura perdida, através de procedimentos de enxertia (Carolina et al., 2019). Para tanto, em todo o mundo, têm sido feitos esforços para criar uma classe de materiais para esse fim (Liu et al., 2015).
A quantidade de tecido ósseo recém-formado foi 4 vezes maior no produto Bio Oss (Paknejad et al., 2014). Isto representa uma séria desvantagem relativamente à necessidade de dois locais cirúrgicos, um doador e um receptor (Iaquinta et al., 2019).
OBJETIVO
MATERIAIS E MÉTODOS
A anestesia foi realizada por via intraperitoneal, 1 ml para cada 100 g de combinação de medicamentos em 8,5 ml de solução salina 0,9%. Após o segundo banho, a inclusão foi realizada em Paraplast™ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) a 65ºC. Os cortes foram coletados em lâminas silanizadas para realização de técnicas histológicas e imunohistoquímicas, montadas em resina Entellan.
Os cortes foram então corados com corante Fucsina Ácida de Ponceau por 5 minutos, lavados com ácido acético a 1%, embebidos em solução de ácido fosfomolíbdico laranja G até a descoloração do colágeno e, em seguida, lavados em ácido acético a 1% por 30 segundos. Em seguida, os cortes foram corados na solução verde clara por 5 min, lavados em ácido acético 1% por 5 min e secos suavemente, retirando apenas o excesso. A seguir, os cortes foram rapidamente imersos em álcool absoluto, desidratados em álcool 95% e álcool absoluto, 3 vezes cada, e clareados em 3 banhos de xilol.
No protocolo da técnica de imunomarcação para OPN e VEGF, os cortes foram primeiramente desparafinizados em 3 banhos de xileno (5 minutos), hidratação em 3 banhos de etanol e água destilada - 5 minutos cada), incubação dos cortes com peróxido de hidrogênio a 3%. diluído em água destilada por 15 min, protegido da luz, para inibir a peroxidase endógena, e lavado em 3 banhos de tampão PBS pH 7,2 (5 min cada). Para avaliar a matriz tecidual ossificada, a marcação OPN foi realizada seguindo o processo de marcação descrito acima. Em que a recuperação antigênica foi realizada em tampão citrato pH 6,0 a 60ºC (20 minutos), deixado esfriar, lavado em 3 banhos com tampão PBS pH 7,2 (5 minutos cada) e sítios inespecíficos bloqueados com PBS/BSA 3%. por 20 minutos.
Os cortes foram continuados incubando os cortes com o anticorpo primário anti-Osteopontina (Santa Cruz, sc-21742) diluído em PBS/BSA durante a noite na geladeira (4ºC), em câmara umidificada e lavados em 3 banhos de tampão PBS pH 7 .2 (5 minutos cada). Em seguida, foi realizada a recuperação antigênica em tampão citrato pH 6,0 a 96ºC (20 minutos), deixado esfriar, lavado em 3 banhos de tampão PBS pH 7,2 (5 minutos cada), e em seguida bloqueadas as amostras inespecíficas com PBS 3%/ BSA por 20 minutos. À temperatura ambiente, incubado com o anticorpo secundário biotinilado (VECTASTAIN®. Universal Quick HRP Kit) por 1 hora, lavado em 3 banhos de tampão PBS pH 7,2 (5 minutos cada) e incubado com estreptavidina VECTASTAIN® Universal Quick HRP Kit), para 30 minutos.
RESULTADOS
A coloração Tricromo de Goldner revelou, nos Grupos BO com xenomaterial (Figuras 12C e 12D) e Grupo REG com material alogênico (Figuras 12E e 12F), a presença de biomaterial (seta amarela aberta) sustentado por fibras colágenas coradas (seta amarela). Com esses dados, percebe-se que o número médio de áreas coradas pelo Tricromo de Goldner, que expressa a deposição de tecido ósseo neoformado, foi mais de 10 vezes maior no grupo REG do que no grupo BO. Neste caso, pode-se concluir que houve acentuada deposição de osso imaturo no Grupo REG tratado com biomaterial alogênico.
Legenda: (A) Gráfico de quantificação da rotulagem Goldner Trichrome e (B) tabela de valores de quantificação da rotulagem Goldner Trichrome. Quanto à marca com OPN, no grupo CTRL ela estava espalhada por toda região, apresentando leve marca acastanhada (Figura 14A), apresentando poucos indícios de ossificação na região. No Grupo REG (Figura 14D), imunomarcado por OPN, foi encontrada região ossificada (seta verde) e na Figura 14E é visualizado o envelope de células da linhagem osteogênica (seta branca).
A seta verde representa uma região ossificada no cluster REG e a seta branca representa uma célula fechada de linhagem osteogênica. Legenda: (A) gráfico de quantificação da imunomarcação para osteopontina e (B) tabela de valores quantitativos de imunomarcação para osteopontina. A imunomarcação do VEGF mostrou regiões marrons associadas aos três grupos, sendo menos intensa no Grupo CTRL (Figura 16A).
No grupo REG, observa-se extensa formação de vasos sanguíneos (seta vermelha) com acentuada proliferação de células endoteliais (Figura D e E). A tabela comprova que no grupo REG o número médio de áreas marcadas com VEGF foi 58,55% maior que no grupo. Legenda: (A) gráfico de quantificação da imunomarcação VEGF e (B) tabela de valores de quantificação da imunomarcação VEGF.
DISCUSSÃO
A expressão de Cx43, sialoproteínas e fosfatase alcalina é estimulada pelo aumento da concentração extracelular de Ca2+ (Wagner et al., 2017). A diminuição da expressão de Cx43 afeta negativamente a mineralização óssea, promovendo alterações na diferenciação e função dos osteoblastos (Lecanda et al., 2000). O biomaterial deve fornecer suporte para a formação microvascular inicial e para a fixação das células ósseas do hospedeiro ao defeito ósseo, e sob estimulação do biomaterial, as células ósseas são reativas, formando uma região osteogênica ao seu redor e desempenhando assim o papel de osso . cordão (Ge et al., 2019; Petersen et al., 2018).
Um tamanho de poro de pelo menos 40 μm tem potencial para desenvolver o crescimento ósseo, enquanto um tamanho de poro de 100–350 μm é considerado adequado para o crescimento ósseo (Chatzipetros et al., 2018; Ge et al., 2019; Jeong et al., 2018; Ge et al., 2019; Jeong et al. , 2019). O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) é um modulador celular que induz mitose e está associado à proliferação de células endoteliais e vasos sanguíneos, além de aumentar a permeabilidade vascular e contribuir para a formação de edema (Da Silva Pires et al., 2021; Diomede et al., 2021; Diomede et al. al. et al., 2020; Harada et al., 1994). A própria criação do sítio cirúrgico, associada a substitutos ósseos, pode aumentar a neovascularização e criar o suporte necessário inicialmente requerido para a osteogênese (Da Silva Pires et al., 2021).
A formação de novos vasos é essencial para o fornecimento nutricional das estruturas em desenvolvimento, e esta atividade está intimamente relacionada ao VEGF secretado pelos osteoblastos (De Campos Pessoa et al., 2020; Harada et al., 1994; Lopes et al., 2019) . Em um estudo que analisou as propriedades de uma nano-hidroxiapatita e de blocos de coral recobertos com VEGF, foi encontrada uma migração massiva de células endoteliais com a formação de uma rede de vasos não uniformemente distribuída, que aumenta de densidade em relação ao tempo (Du e outros, 2015). Materiais biocerâmicos de hidroxiapatita carbonizada modulam a quantidade de VEGF local além de realizarem interações iônicas devido à sua rugosidade superficial (Adams et al., 2013).
Os capilares sinusoidais geralmente apresentam um maior número de células progenitoras ao seu redor (Grosso et al., 2017; Kunisaki et al., 2013). A biocerâmica composta por HA-TCP libera Ca2+ mais rapidamente, além de apresentar superfície rugosa e irregular que aumenta a adesão celular, levando à síntese e mineralização da MEC (Seol et al., 2014). O material nanométrico possui 50% mais área superficial que o material micrométrico, permitindo maior aporte de área para impregnação líquida (Da Silva Brum et al., 2019).
