Objetivos Geral
Objetivos Específicos
Amostras bacterianas
Identificação bacteriana
Coloração de Gram
Fator CAMP (Christie, Atkins, Munch-Petersen)
Identificação das amostras por sorologia
Para realizar a coloração de Gram, foi feita uma coloração em alça de platina de uma colônia bacteriana cultivada em uma placa de ágar sangue contendo 5% de eritrócitos de ovelha. Após o esgotamento da bateria de corantes, a lâmina foi enxaguada em água corrente e deixada secar em posição vertical para posterior observação ao microscópio, utilizando objetiva de imersão (100x). A enzima de extração para estreptococos (DR593) do kit Oxoid foi reconstituída em água destilada estéril em 10 mL, à qual foram adicionadas alíquotas de 400 µL de 2–4 colônias isoladas de cada amostra e incubadas em banho-maria por 10 min a 37°C. , abaixo de 37°C de temperatura. tremendo..
Posteriormente, uma gota de cada reagente contendo partículas de látex revestidas com anticorpos contra os grupos A, B, C, D, F e G de Lancefield foi distribuída em círculos no cartão de reação (DR500), e posteriormente foi adicionada uma gota do extrato. bacteriano/círculo. O resultado foi positivo quando ocorreu aglutinação em um dos reagentes do grupo Lancefield (A, B, C, D, F ou G) ou se um dos reagentes apresentou reação significativamente mais forte que os outros cinco grupos de estreptococos.
Identificação molecular das amostras bacterianas
Genotipagem Capsular
Eletroforese em campos elétricos alternados (Pulsed FieldGel
Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos
Método de disco-difusão
Determinação da concentração mínima inibitória (CMI) de penicilina e
Após a incubação, a leitura foi feita de acordo com a área do halo na tira E-teste. A determinação da concentração inibitória mínima foi realizada para amostras resistentes à tetraciclina, eritromicina e clindamicina pelo método de difusão em disco (ponto 3.4.1). Amostras bacterianas foram cultivadas em caldo THB, padronizado na escala McFarland 0,5 em solução salina estéril 0,9% e inoculadas (5 µL) em Müller-Hinton contendo 5%.
A concentração inibitória mínima foi considerada como a menor concentração de antibiótico que não apresentou crescimento do microrganismo após 48 horas de incubação.
Teste D
Tabela 5 – Perfil de resistência à eritromicina de amostras de Streptococcus agalactiae multirresistente (RMD) isoladas de mastite bovina subclínica. Amostras de origem bovina apresentaram maior capacidade de formação de biofilme em comparação com amostras de origem humana (Figura 7A). Nota: Análise quantitativa da formação de biofilme por amostras de Streptococcus agalactiae (n=16) de origem bovina com diferentes tipos de pulso de PFGE após 24 horas, 48 horas e 72 horas de incubação.
Nota: Produção de biofilme em superfícies abióticas em diferentes níveis de acidez e intervalos de tempo (24 h, 48 h e 72 h) por sete isolados bovinos representativos de Streptococcus agalactiae tipo II, originários de mastite subclínica. Caracterização de isolados de Streptococcus agalactiae de origem bovina e humana por análise polimórfica de DNA amplificado aleatoriamente. Diversidade genética e caracterização fenotípica de isolados de Streptococcus agalactiae do Rio de Janeiro, Brasil.
Molecular characterization of Streptococcus agalactiae isolates from pregnant and non-pregnant women in Yazd University Hospital, Iran.
Detecção dos genes de resistência à eritromicina
Teste de aderência com N-hexadecano
Após esse período, a fase aquosa foi lida para análise de hidrofobicidade conforme a seguinte fórmula: ([DO inicial – DO final/DO inicial]x100).
Formação de biofilme em microplacas de poliestireno
Formação de biofilme na presença de glicose e variação de pH
Para avaliar a formação de biofilme em resposta a diferentes níveis de pH e suplementação de meio THB com glicose a 1%, biofilmes foram formados em placas de poliestireno de 96 poços por 24 h, 48 h e 72 h com THB suplementado com glicose a 1% ou THB com diferentes pH. , ajustado com HCl ou NaOH conforme descrito anteriormente99.
Análise morfológica do biofilme através da microscopia eletrônica de
Análise estatística
Identificação das amostras de Streptococcus agalactiae
Diversidade foi observada entre os padrões de fragmentação de DNA para a maioria das amostras humanas examinadas. Apenas a amostra 81779/V não foi submetida ao ensaio de PFGE por ser uma das últimas amostras incluídas na coleção de cultura LBMFE. O dendograma foi construído no software BioNumerics e a análise de similaridade pelo coeficiente Dice.
O DNA de amostras bacterianas após extração com lisozima/mutanolisina (100U/50U) foi digerido com 12U da endonuclease Smal, submetido à eletroforese em campos elétricos alternados e o perfil de fragmentação foi analisado utilizando o software Bionumerics versão 2.0. O DNA de amostras bacterianas após extração com lisozima/mutanolisina (100U/50U) foi digerido com 12U da endonuclease Smal, submetido à eletroforese em campos elétricos alternados e o perfil de fragmentação foi analisado utilizando o software Bionumerics versão 2.0.
Perfil de susceptibilidade fenotípica e genotípica aos antimicrobianos
- Disco-difusão
- Determinação da concentração mínima inibitória (CMI)– E-Teste
- Determinação da concentração mínima inibitória (CMI)– Diluição em
- Teste D
Segundo a tetraciclina, 87,5% das amostras foram resistentes, sendo todas as amostras com sensibilidade média à tetraciclina (n=3) resistentes. Não houve correlação entre genótipo capsular, padrão de PFGE e suscetibilidade antimicrobiana entre amostras isoladas de mastite bovina. A taxa de susceptibilidade à clindamicina para um único isolado de origem humana foi semelhante à da maioria das amostras de mastite bovina (0,125 µg/mL).
As amostras analisadas não apresentaram achatamento no halo de clindamicina (halo “D”) adjacente à eritromicina, o que é considerado negativo para o teste D.
Detecção de genes de resistência a eritromicina – PCR
Teste de Hidrofobicidade com N-hexadecano
Análise da Formação de Biofilme
A maioria das amostras (n=6) mostrou um aumento de 4-7 vezes na formação de biofilme em comparação com THB sem 1% de glicose. A formação de biofilme nos períodos de incubação de 48 e 72 horas foi semelhante à observada no período de 24 horas (dados não mostrados). Nota: Efeitos da glicose na formação de biofilme em amostras de Streptococcus agalactiae (n=07) tipo II, com diferentes padrões de PFGE, isoladas de bovinos com mastite subclínica. A) Os ensaios de biofilme em microplacas de poliestireno foram realizados utilizando meio de cultura THB e THB suplementado com glicose a 1% em pH 7,2.
A microscopia de fluorescência ilustrou diferenças na formação de biofilme da amostra 02/A1 em THB (B) e THB com 1% de glicose (C). Diferenças nos níveis de formação de biofilme na presença de THB em pH neutro foram verificadas para todas as amostras estudadas. A formação de biofilme em THB pH 7,2 foi dependente do tempo (p<0,02), onde as amostras caracterizadas como fortes produtoras (+++) iniciaram após 72 horas de incubação (Figura 9A).
Por outro lado, a formação de biofilme pela amostra 159/C foi significativamente reduzida (p<0,04) após 24 horas de incubação. Os dados destacam que variações nos valores de pH afetaram os níveis de formação de biofilme das amostras bovinas de S.agalactiae testadas. Distribuição de sorotipos e suscetibilidade antimicrobiana de Streptococcus agalactiae isolado de tilápia cultivada infectada (Oreochromis niloticus) na Tailândia: perspectiva de nove anos.
Distribution of 132 serotypes and antimicrobial resistance genes among Streptococcus agalactiae isolates from bovine and human hosts. Multiple-locus variant repeat assay (MLVA) is a useful tool for molecular epidemiological analysis of Streptococcus agalactiae strains causing bovine mastitis. Molecular epidemiology and distribution of serotypes, genotypes and antibiotic resistance genes of Streptococcus agalactiae clinical isolates from Guelma, Algeria and Marseille, France.
Complete genome sequence of Streptococcus agalactiae strain GBS85147 serotype of type Ia isolated from human oropharynx. Comparison of virulence factors and capsule types of Streptococcus agalactiae isolated from human and bovine infections. Antibiotic susceptibility and mechanisms of erythromycin resistance in clinical isolates of Streptococcus agalactiae: French multicenter study.
