Os resultados obtidos nos experimentos de formação de biofilme em microplacas de poliestireno nos tempos de 24h, 48h e 72h,demonstraram que as amostras de S. agalactiae de origem humana apresentaram baixa capacidade de formação de biofilme (DO570 ≤ 0,6). Para a maioria das amostras estudadas, a produção de biofilme foi tempo-independente. Os dados mostraram um declínio na formação de biofilme nos tempos de 48h (n=7; 43,75%) e 72h (n=12; 75%) de incubação (Figura 6).
0 0,5 1 1,5
Cristal violeta (DO570)
Streptococcus agalactiae 24h 48h72h
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Nota: (n=16) de origem humana apresentando diferentes pulsotipos de PFGE após24h, 48h e 72h de incubação. A formação de biofilme em superfície de poliestireno foi realizada através de ensaios em microplacas de poliestireno usando meio de cultura THB pH 7,2. Os valores médios e os desvios padrão de três experimentos independentes estão mostrados na Figura. *, Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas pelos testes da variância (ANOVA) e t de Student (p <0,05).
Fonte: A autora, 2016.
Figura 6 – Formação de biofilme por amostras de Streptococcus agalactiae de origem humana
As amostras de origem bovina apresentaram maior capacidade de formação de biofilme em relação às amostras de origem humana (Figura 7A). A produção de biofilme foi tempo-dependente para todas as amostras analisadas. Após 24h de incubação, 12,5% (n=2) foi classificada como forte produtora (+++) de biofilme, 50% (n=8) como elevada (++), 6,25%
(n=1), moderada (+) e 31,25% (n=5) como fraca produtora de biofilme. Contudo, diferenças significativas (p<0.01)na formação de biofilme foram detectadas após 48h e 72h de incubação. Um total de 81,25% (n=13) e 93,75% (n=15) das amostras de S. agalactiae tornaram-se forte produtoras (+++) nos tempos de 48h e 72h, respectivamente. Contudo, a amostra 15/B1 expressou uma fraca produção de biofilme independente do tempo de incubação (p < 0.01).
A formação de biofilme pelas amostras de S. agalactiae de mastite bovina foi confirmada por microscopia eletrônica de transmissão (Figura 7B-D).A intensificação da formação de biofilme pela amostra 02/A1 foi verificada nos diferentes períodos de incubação.
Pequenos agregados bacterianos foram observados durante 24h (Figura 7B), enquanto multicamadas de agregados bacterianos envoltos por uma fina matriz adesiva foram detectadas em 48 h (Figura 7C) e 72 h (Figura7D) de incubação.
Nota: Análise quantitativa da formação de biofilmes por amostras de Streptococcus agalactiae (n=16) de origem bovina apresentando diferentes pulsotipos de PFGE após 24h, 48h e 72h de incubação. A formação de biofilme em superfície de poliestireno foi realizada através de ensaios em microplacas de poliestireno usando meio de cultura THB pH 7,2.
Microscopias eletrônicas de varredura mostraram a formação de biofilme tempo- dependente da amostra 02/A1: 24h(B), 48h (C) e 72h (D) de incubação. Os valores médios e os desvios padrão de três experimentos independentes estão mostrados na Figura. *, Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas pelos testes da variância (ANOVA) e t de Student (p <0,05). Barras aumento: 50 e 100 µm.
Fonte: A autora, 2016.
A prevalência da alta capacidade de formação de biofilme pelas amostras de origem bovina em relação às amostras de origem humana sugere uma maior capacidade de aderência pelas amostras bovinas, podendo estar relacionada ao grau de hidrofobicidade desses isolados.
Com base nos resultados demonstrados pelas amostras bovinas para formação de biofilme, selecionamos sete amostras para os experimentos de suplementação do meio THB com 1% de glicose e variações de pH sem 1% de glicose. Após 24h incubação,a adição de 1%
de glicose (THB pH7,2) aumentou a capacidade de produção de biofilme em todas as amostras analisadas(Figura 8). A maioria das amostras (n=6) apresentou um aumento entre 4- 7 vezes na formação de biofilme em relação ao THB sem 1% de glicose. Das sete amostras
Figura 7 – Formação de biofilme por amostras de Streptococcus agalactiae de origem bovina
analisadas, seis (85,7%) foram classificadas como forte produtoras de biofilme. Somente a amostra 159/C apresentou um aumento na formação de biofilme menos expressiva(p<0,05). A formação de biofilme nos períodos de 48h e 72h de incubação foram semelhantes aos observados em 24 h (dados não apresentados). Biofilmes produzidos em THB com 1% de glicose, exibiram maior biovolume (Figuras 8B e 8C), bem como aumento do número de células viáveis indicadas pela razão verde/vermelho observada nos ensaios de live/dead (dados não apresentados).
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
Controle 02/A1 03/A2 15/B1 22/B1 60.2/C 159/C 87/D
Cristal Violeta(DO570)
Streptococcus agalactiae THB THB + 1% Glicose
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A
B C
Figura 8 – Formação de biofilme por amostras de Streptococcus agalactiae isoladas de mastite bovina subclínica em meio THB suplementado com 1% de glicose
Nota: Efeitos da glicose sobre a formação de biofilme por amostras Streptococcus agalactiae (n= 07) tipo II, de diferentes padrões de PFGE isoladas de bovinos com mastite subclínica. (A) Os ensaios de biofilme de microplacas de poliestireno foram realizados usando meio de cultura THB e THB suplementado com glicose com 1% em pH 7,2.
Microscopias de fluorescência ilustraram diferenças na formação de biofilme da amostra 02/A1em THB (B) e THB com glicose com 1% (C). Aumento 1000x.
Fonte: A autora, 2016.
Os dados dos experimentos de formação de biofilme usando THB sem glicose com diferentes níveis de pH nos tempos de 24h, 48h e 72h de incubação estão apresentados na Figura 9A-D. Diferenças nos níveis de formação de biofilme na presença de THB em pH neutro foram verificadas para todas as amostras estudadas. A formação de biofilme em THB pH 7,2 foi tempo-dependente (p<0,02), onde as amostras passaram a ser caracterizadas como forte produtoras (+++) após 72h de incubação (Figura 9A)
Os ensaios realizados com THB pH 6,5 mostraram que após 24h e/ou 48h, a maioria das amostras 85,7% (n=06), incluindo a amostra 15/B1 (fracaformadora de biofilme em THB sem glicose a pH 7.2) que tornou-se forte produtoras de biofilme (p< 0,02). Por outro lado, foram encontrados níveis baixos de formação de biofilme para amostra 159/C bovina em THB pH 6,5 e pH 7,2, quando comparado com as outras seis amostras de S.agalactiae testadas (p<0,02).
A formação de biofilme em THB pH 5,5 demonstrou uma forte produção de biofilme (+++) até 72h de incubação para 85,7% (n=06) de bovino isolados. Por outro lado, a formação de biofilme pela amostra 159/C foi significativamente reduzida (p<0,04) após24h de incubação.
Os resultados mostraram que todas as sete amostras testadas apresentaram a menor capacidade (DO570nm < 1,5) de formação de biofilme quando os ensaios foram realizados com THB pH 4,2 sem glicose (24h, 48h e 72h de incubação) (Figura 9D).
Nossos resultados demonstraram que o meio acidificado THB pH 6,5 e THB pH 5,5, bem como THB suplementado com 1% de glicose em pH neutro (Figura 8) resultou num aumento da formação de biofilme para a maioria das amostras testadas. Algumas amostras atingiram níveis de fortes produtoras (+++).
Para a maioria das amostras de S.agalactiae bovina, o crescimento de formas sésseis em THB suplementado com 1 % de glicose versus THB sem glicose a pH 7,2 resultou na acidificação do meio de cultura para pH 5,0 e pH 6,0, respectivamente. No entanto, para a amostra 159/C, caracterizada como moderada (+) produtora de biofilme, o crescimento bacteriano resultou na acidificação da cultura para pH 4,0 e pH 5,0, respectivamente. Dados enfatizam que as variações em valores de pH influenciaram os níveis de formação de biofilme das amostras de S.agalactiae bovina testadas.
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
Cristal Violeta(DO 570)
24h 48h 72h
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B
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Cristal Violeta(DO570)
24h 48h 72h
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C
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Cristal Violeta(OD570)
Streptococcus agalactiae
24h 48h 72h
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D
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Cristal Violeta(DO570)
24h 48h 72h
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A
pH 7,2 pH 6,5
pH 5,5 pH 4,2
Figura 9 – Produção de Biofilme de Streptococcus agalactiae isolados de mastite bovina subclínica
Nota: Produção de biofilme em superfície abiótica em diferentes níveis de acidez e intervalos de tempo (24h, 48h e 72h) por sete isolados bovinos representativos de Streptococcus agalactiae tipo II, oriundo de mastite subclínica. Os ensaios de biofilme de microplacas de poliestireno foram realizados utilizando o meio de cultura THB. Os valores médios e desvios-padrão de três experimentos independentes são mostrados. *, Diferença estatisticamente significativa determinada pelo teste t de Student (p <0,05).
Fonte: A autora, 2016.
4 DISCUSSÃO
Nos últimos anos o S. agalactiae tem sido uma das principais bactérias envolvidas em infecções invasivas em neonatos, idosos e adultos imunocomprometidos101. Cerca de 30% das mulheres são portadoras de S. agalactiae, podendo ser essa colonização vaginal e/ou retal, permanente, intermitente ou transitória32. O número de crianças nascidas dessas mulheres colonizadas, que são contaminadas podem chegar a 75% e na ausência de qualquer intervenção, cerca de 1-2% dos neonatos desenvolvem infecção por S. agalactiae32.
O S. agalactiae também é responsável por infecções bacterianas em outros animais, como camelos, cães, cavalos, focas, aves, golfinhos, gatos, hamsters, sapos, crocodilos e macacos42.
O patógeno pode provocar epidemias graves em peixes de viveiro, causando meningoencefalite, septicemia e hemorragias, tanto em espécies de água doce como de água salgada102. O consumo de peixes pode estar associado com o aumento do risco de colonização por S. agalactiae dos sorotipos Ia e Ib em humanos103, 104.
Segundo Duarte et al.89, as taxas de infecção por S. agalactiae varia entre rebanhos, verificando-se maiores prevalências em rebanhos que apresentaram medidas de controle negligenciadas. No Brasil, este agente é relacionado como um dos principais agentes etiológicos da mastite bovina com prevalência média de ~80%105, 46 . O Brasil é um grande produtor de leite, no ano de 2015, produziu 24,05 bilhões de litros de leite106. A contaminação do leite pelo S. agalactiae leva à degradação de proteínas, principalmente da caseína (75%) que tem grande importância para a indústria láctea107. A mastite bovina é uma doença que acarreta um grande prejuízo econômico na indústria de lacticínios, devido a diminuição da produção de leite108.
O S. agalactiae pode ser classificado em 10 sorotipos distintos (Ia, Ib-IX), de acordo com a cápsula polissacarídica, com base na reatividade com anti-soros específicos utilizando testes de aglutinação em látex109. Porém o número de isolados não tipáveis tem sido um problema crescente3, onde 5-20% das amostras isoladas de humanos e 30-77% daquelas obtidas a partir de mastite bovina não são tipáveis4. Devido a essa limitação da sorologia, técnicas moleculares têm sido implementadas nos laboratórios para identificação do S.
agalactiae. Métodos de tipagem molecular desenvolvidos com base na amplificação por PCR tem sido capazes de identificar os diferentes tipos capsulares em grande número de isolados93,
110. Os testes baseados em análise do DNA diminuem a probabilidade de erros apresentados pelos métodos tradicionais de identificação bacteriana, sendo mais rápidos e eficientes111, 112.
Todas as amostras analisadas nesse estudo foram genotipadas por PCR multiplex (Figuras 2 e 3). As amostras humanas obtidas de casos clínicos diversos apresentaram uma maior prevalência do genotipo V (37,5%), seguido dos genotipos III (31,25%), Ia (25%) e II (6,5%). Estes resultados estão diferentes dos dados publicados na África do Sul, utilizando a mesma metodologia e 413 amostras de gestantes, onde a prevalência foi do genotipo III (34.3%), seguido dos genotipos Ia (22.9%), V (14.3%), Ib (11.4%), IV (8.5%), II (5.7%) e não tipáveis (8%)113. Dados publicados na Turquia relataram a prevalência do genotipo III (75%), seguido pelos genotipos V (31%), II (17%), Ib (11%) e não tipáveis (3%) em 139 amostras analisadas114. Com relação aos dados publicados no Brasil, a tipagem das amostras humanas e bovinas foi realizada por sorologia, com prevalência do sorotipo III e grande número de amostras não tipáveis89, 115. Todas as amostras de S. agalactiae isoladas de bovinos com mastite subclínica em fazendas do Nordeste do Brasil pertenceram ao genotipo II (Figura 3). Não houve amostras não tipáveis nesse estudo, ressaltando a importância da introdução de técnicas moleculares para identificação do S. agalactiae. No Brasil, estudos anteriores com S. agalactiae isolados de leite de vacas com mastite clínica ou subclínica da região Sudeste mostrou por sorologia o sorotipo III como predominante (77,6%), seguido pelos sorotipos II, Ia, Ib, e VI89.
Tettelin et al.116 sugeriram que a sorotipagem não é o método mais adequado para avaliar o nível de diversidade genética e padrões evolutivos do S. agalactiae, sendo necessária uma análise que permitisse a diferenciação das amostras similares de forma molecular. O PFGE é considerado um método mais eficaz, pois consegue separar o DNA em fragmentos grandes e analisar o padrão de restrição pela ação de campos elétricos alternados, utilizando uma enzima de restrição que varia de espécie para espécie117, 118. Analisando os dados do PFGE das amostras humanas e bovinos foram detectados 14 pulsotipos e 6 pulsotipos distintos, respectivamente (Figuras 2 e 3). Nossos resultados demonstraram a heterogeneidade das amostras isoladas de humanos e animais, conforme previamente descrito89, 119.
A principal ferramenta para o controle da mastite bovina, é a intervenção terapêutica, o que leva a um freqüente uso de antimicrobianos nas fazendas leiteiras120. Porém, com o surgimento da resistência aos antimicrobianos a eficiência desses agentes é influenciada121.
A penicilina é principal antibiótico recomendado para a profilaxia de gestantes colonizadas com o S. agalactiae por conta de sua eficácia, baixo custo e amplo espectro de ação. No presente estudo não foram encontradas amostras resistentes ou intermediárias à
penicilina, o que já foi reportado por alguns autores122, 123, 124. A concentração mínima inibitória (CMI) para penicilina apresentada pelas amostras deste trabalho variou entre 0,03 µg/mL-0,12µg/mL (Tabelas 3 e 4), permanecendo como o antibiótico de escolha para o tratamento das infecções por esse microrganismo. Outros antibióticos são utilizados como alternativa para infecções relacionadas ao S. agalactiae, como a eritromicina, clindamicina, vancomicina e tetraciclina94. O aumento da resistência a esses antibióticos tem sido relatado por diversos autores125, 126, 127, 122. No presente trabalho, as amostras humanas (Tabela 1) apresentaram resistência a tetraciclina (62,5%), azitromicina (25%) e clindamicina (6,5%), sendo uma amostra (2013-01) classificada como multiresistente, estando de acordo com dados publicados anteriormente para tetraciclina e clindamicina128. Contudo, nossos resultados demonstraram elevado grau de resistência a azitromicina, um antimicrobiano cogitado para ser incluído no sistema de prevenção de infecções invasivas por S. agalactiae129, indicando uma possível falha na profilaxia das infecções por esse patógeno, em amostras da nossa comunidade. Com relação às amostras isoladas de mastite subclínica bovina, o perfil de resistência a tetraciclina (87,5%) e azitromicina, clindamicina e eritromicina foi mais elevado (25%). Essas amostras foram classificadas como multirresistentes a drogas. Atualmente, tem sido visto um aumento significativo de amostras resistentes a eritromicina, testes de análise de sensibilidade aos antimicrobianos e de genes de resistência são de suma importância para controle e prevenção das infecções por S. agalactiae.
Estudo realizado por Corrêa et al.13, 85% das amostras resistentes a eritromicina apresentaram o fenótipo CMLSB. Este fenótipo pode ser usado para identificar não só as amostras resistentes a eritromicina, mas também amostras resistentes a clindamicina e estreptograminas B. No presente trabalho 100% das amostras analisadas pelo test D (Figura 4) apresentaram esse fenótipo, sendo que todas possuíram o gene ermB e 75% os genes ermB e mefA/E. Nossos resultados foram semelhantes aos descritos por Betriu et al.130 que relataram a presença do gene ermB em 70% das amostras analisadas. Outros estudos também demostraram a maior prevalência desse gene em relação a resistência a eritromicina131, 16, 132.
A capacidade da bactéria aderir e invadir as células do hospedeiro está relacionado a diversos fatores, sendo a hidrofobicidade um deles. Componentes da superfície celular podem promover ou reduzir as propriedades que coexistem na superfície bacteriana, alterando na estrutura da matriz de polissacarídeos durante o crescimento bacteriano. Observamos no presente trabalho que as amostras de origem humana apresentaram um perfil heterogênico de hidrofobicidade (Figura 5A), onde 56,25% foram classificadas como moderadamente hidrofílicas ou hidrofílicas, enquanto as bovinas apresentaram um padrão mais homogêneo
com 75% das amostras hidrofóbicas (Figura 5B), o que nos permite relacionar o perfil de hidrofobicidade com a capacidade de formação de biofilme.
A prevalência da alta concentração de biofilme pelas amostras de origem bovina em relação às amostras de origem humana, sugere a influência da hidrofobicidade observada (Figuras 6 e 7). Os resultados obtidos neste trabalho, estão de acordo com o que foi observado por Rodrigues et al.133, em pesquisa com Salmonella spp., onde as amostras hidrofóbicas ou moderadamente hidrofóbicas apresentaram maior capacidade de formar biofilme no período de 24h, sugerindo que quanto maior o tempo de contato com a superfície, maior a chance de aderência do microrganismo e consecutivamente da formação de biofilme. Além disso, nossos resultados mostraram uma maior aderência à superfície abiótica pelas amostras de origem bovina, sugerindo um maior grau de disseminação e virulência, principalmente em rebanhos com mastite subclínica.
Inúmeros estudos têm demonstrado a capacidade de formação de biofilme por S.
agalactiae134, 135, 8. Neste trabalho a adição de 1% de glicose ao meio aumentou a capacidade de formação de biofilme inicial das amostras e bovinas (Figura 8), o que está de acordo com os resultados obtidos por D’Urzo et al.99 que utilizou o pH 5,0 e observou a forte formação de biofilme em meios não-tamponados contendo 1% glicose, confirmando que a glicose favorece a formação de biofilme por S. agalactiae. Dados descritos por Marsh136, bactérias em biofilmes metabolizam rapidamente açúcares, produzindo ácidos que criam um microambiente mais ácido. Ao utilizarmos a fita indicadora de pH foi possível observar essa acidificação do meio, onde todas as amostras de S. agalactiae foram capazes de acidificar o meio THB com 1% de glicose durante a formação de biofilme para um pH próximo de 6,0.
Em casos de mastite, a glândula mamária é o principal reservatório, onde o microrganismo entra através do canal do leite, interage com as células mamárias e se multiplica, causando a infecção137. Provavelmente, o pH ácido do leite entre 6,5-6,8 pode ser um fator importante para formação de biofilme, conforme demonstrado no presente trabalho.
Outros autores encontraram quantidades maiores de formação de biofilme a pH 6,5 em comparação com pH 4,2, provavelmente devido ao crescimento bacteriano pobre em pH baixo138, 139, 140 . Em contraste, Ho et al.8 verificaram que o baixo pH induzia a formação de biofilme em meio de cultura com nutrientes limitados (M9YE) e não em meios de cultura ricos, como caldo Todd-Hewitt (THB). No presente estudo, a formação de biofilme em pH 4,2 foi bem menor quando comparada com os pH 5,5 e 6,5, sugerindo que o meio ácido favorece a produção de biofilme pela amostras de S. agalactiae, principalmente o pH 6,5.
Estudos com S. agalactiae são de grande importância, visto que eles estão relacionados à diversas patogenias que acometem ao homem e demais animais. No Brasil são poucos os estudos comparando amostras humanas e bovinas, o que faz do presente trabalho relevante para a pesquisa com S. agalactiae no Brasil. Com base nos dados obtidos até o momento, concluímos que o S. agalactiae é um microrganismo capaz de formar biofilme, principalmente as amostras de origem bovina, podendo estar relacionado com fatores de virulência e com disseminação entre animais do mesmo rebanho, bem como uma possível contaminação humana a partir de uma linhagem bovina.
CONCLUSÕES:
a) os genotipos mais prevalentes em amostras de Streptococcus agalactiae de origem humana foram V, III, Ia e II e para as bovinas II;
b) amostras de S. agalactiae isoladas de humanos apresentaram elevada resistência a azitromicina;
c) amostras de S. agalactiae isoladas de humanos (6,25%) e de mastite subclínica bovina (25%) apresentaram multirresistência a drogas;
d) as amostras bovinas foram classificadas como hidrofóbicas enquanto as humanas apresentaram um padrão heterogêneo de hidrofobicidade;
e) todas as amostras analisadas de S. agalactiae de origem humana e bovina foram capazes de formar biofilme em superfície abiótica;
f) as amostras de origem bovina apresentam uma maior capacidade de formação biofilme comparada com as amostras de origem humana;
g) não houve relação entre pulsotipo PFGE, susceptibilidade aos antimicrobianos e capacidade de formação de biofilme;
h) a adição de 1% glicose no meio potencializou a formação de biofilme;
i) a acidificação do meio (pH 5.5 - 6.5) promoveu maior formação de biofilme.
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