A actividade de AChE destes tecidos foi determinada pelo método de Ellman et al. Pode-se destacar a necessidade de distúrbios anti-hiperglicêmicos, antitumorais, cardiovasculares e do sistema nervoso central (SNC) (BARBOSA-FILHO et al., 2006; WAGNER, 2009). Dentre os distúrbios do SNC, destaca-se a doença de Alzheimer (DA), uma patologia irreversível e progressiva caracterizada pela deterioração neuronal que resulta na perda de funções cognitivas, como memória, capacidade de comunicação, julgamento e raciocínio (LANCTÔT et al., 2003) .
Objetivo Geral
Objetivos Específicos
Aspectos gerais sobre plantas medicinais
Tais dados enfatizam claramente a importância contemporânea das substâncias naturais para a manutenção da saúde e a cura de doenças e, portanto, estimulam a indústria farmacêutica e mostram a importância das atividades desempenhadas pelos químicos de produtos naturais que se dedicam aos produtos naturais produzidos pelo metabolismo da vida. organismos e por profissionais de áreas similares. A variedade de padrões estruturais encontrados em diferentes classes de produtos naturais como flavonóides, terpenos, isoflavonóides, lignanas, neolignanas, glicosídeos, cumarinas, cromonas, isocromonas, quinonas, alcalóides de diferentes categorias, entre outros, atestam sua diversidade de extraordinária estrutura. suprimento inesgotável de modelos originais de arquitetura molecular (SIMÕES et al., 2003; . BUTLER, 2008; NIERO; MALHEIROS, 2009). Em 2001 existiam mais de 150 mil substâncias naturais conhecidas e novas estruturas estão sendo publicadas a uma taxa de cerca de 10 mil por ano (NIERO et al., 2003; GURIB-FAKIN, 2006).
Gênero Rapanea
Aspectos Químico-Farmacológicos
Estas substâncias, juntamente com os ácidos mirsinóicos Ácido E (3,5-digeranil-4-hidroxi)-benzóico (4) e F 5-carboxi-7-(3”-metil-2”butenil dimetilhex-1‟,4' - dienil)-2,3-dihidrobenzofurano (5) foi encontrado em Myrsine segueni e apresentou atividade antiinflamatória (DONG et al., 1999). Nas folhas de Myrsine africana foram encontrados flavonóides com atividade anti-helmíntica e antibacteriana, incluindo 3-(3,4"-diacetilramnosil)-miricetina (11) (AROT; . MIDIWO; KRAUS, 1996). Dos frutos da Mirsina Africana foi possível isolar duas novas benzoquinonas, a metilvilangina (22) e a metilanidrovilangina (23) MANGURO et al., 2003).
Técnicas de isolamento e identificação de produtos naturais
Esta técnica baseia-se na utilização de uma placa de cromatografia circular de camada fina e um motor inclinado, permitindo uma coleta mais eficiente de compostos ou frações. Após o isolamento, a determinação estrutural dos constituintes isolados é realizada por meio de análises por espectroscopia no ultravioleta, infravermelho, ressonância magnética de hidrogênio e carbono-13 e espectrometria de massa (QUOC-TUAN; BERNARD, 2004). O espectro infravermelho de um composto orgânico corresponde ao conjunto de bandas de absorção apresentadas pela amostra exposta à radiação infravermelha e estas bandas correspondem a alterações na energia vibracional dos compostos orgânicos (SIMÕES et al., 2003).
O fenômeno da Ressonância Magnética Nuclear (RMN) ocorre com átomos quando as seguintes condições são atendidas: o átomo possui valor de spin nuclear maior que zero; o átomo, na molécula, está sujeito a um campo magnético externo; o sistema é irradiado com radiação eletromagnética; possuem relação entre os valores do spin nuclear, do campo magnético externo e da frequência de radiação (SILVERSTEIN; BASSLER; MORRIL, 1994). Na ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN de 1H), cada elétron distinto de hidrogênio em uma molécula geralmente tem sua própria absorção. A maioria dos deslocamentos químicos do hidrogênio está na faixa de 0 a 12 ppm, que pode ser facilmente dividida em cinco regiões: 1–2 ppm de hidrogênios de ligação simples, 1,5–3 ppm de hidrogênios insaturados vizinhos, 3-5 ppm de hidrogênios heteroátomos vizinhos, 5- 8 ppm de hidrogênio de aromáticos e olefinas e 8-12 ppm de hidrogênio de aldeídos e ácidos.
Com a ressonância magnética nuclear do carbono-13 (NMR13C), é possível identificar o número de diferentes átomos de carbono em uma molécula de estrutura desconhecida. Além disso, muitas vezes é possível obter informações estruturais sobre uma molécula medindo a massa dos fragmentos produzidos quando as moléculas são fragmentadas (McMURRY, 2005). Os principais elementos que um espectro fornece para caracterizar uma molécula são a massa da molécula (peso molecular), o pico base e a massa dos fragmentos iônicos.
A espectroscopia de RMN complementa o EM e a espectroscopia na região infravermelha e fornece um 'mapa' do esqueleto carbono-hidrogênio de uma molécula orgânica.
Inibidores da AChE e Doença de Alzheimer
Anormalidades nos sistemas cerebrais que utilizam acetilcolina são consideradas características da doença e incluem: (1) uma redução desproporcionalmente grande na quantidade de acetilcolina, (2) uma redução na colina acetiltransferase, uma enzima envolvida na síntese de acetilcolina (KATZMAN, 1986; NORDBERG, CARLSON, WINBLAD degeneração do núcleo basal de Meynert (WHITEHOUSE et al., 1982; COYLE, PRICE, DELONG mudança no número e sensibilidade dos receptores nicotínicos e muscarínicos cerebrais e (5) aumento da sensibilidade aos efeitos anticolinérgicos de drogas como a escopolamina (NEWHOUSE, 1997; SCHRODER, WEVERS, 1998).Além disso, há comprometimento na expressão do RNA mensageiro do receptor nicotínico em neurônios contendo a forma hiperfosforilada da proteína 'tau', sugerindo que disfunções de transporte típicas da DA interferem na formação de receptores colinérgicos (SCHRODER, WEVERS, 1998).Morfologicamente, são encontrados nos neurônios de pacientes com DA, deposição de proteína β-amilóide de forma mais deteriorada do que em idosos da mesma faixa etária. , sem doença.
Assim, observou-se que uma fração significativa da população idosa deve apresentar esses níveis de placas na ausência de manifestações de demência, e foi discutida a ideia de que a deposição de amiloide é apenas uma das maiores entre os vários fatores causadores da doença, embora certamente contribui para o seu mecanismo fisiopatológico (TERRY et al., 1987; GOATE et al., 1991; BRAAK; BRAAK, 1999; NEVE; McPHIE, 2000; RANG et al., 2003). O tratamento sintomático da DA envolve primeiro a restauração da função colinérgica (PERRY, 1986) e subsequentemente a restauração de outros processos neurológicos mediados por outros sistemas de neurotransmissão. Sugere-se, portanto, que um aumento no nível de ACh poderia ser útil na melhoria de um dos sinais da doença, as dificuldades de aprendizagem.
Portanto, os inibidores da enzima AChE, que promove a degradação da acetilcolina, têm demonstrado maior eficácia no tratamento clínico da doença (BIERER et al., 1995; TREVISAN; MACEDO, 2003). Uma das primeiras drogas sintéticas utilizadas no tratamento da DA foi a tacrina (28), mas devido ao alto risco de hepatotoxicidade, caiu em desuso ao longo do tempo. Outra substância utilizada no tratamento da DA foi o cloridrato de memantina (33), um antagonista não competitivo de afinidade moderada para o receptor N-metil-D-aspartato (NMDA), que atua reduzindo a liberação de glutamato.
Inicialmente, o cloridrato de memantina foi testado no tratamento da doença de Parkinson devido ao seu potencial efeito dopamimético, posteriormente descobriu-se que é eficaz no tratamento da DA, embora tenha efeito relativamente discreto (WINBLAD; PORITIS, 1999; REISBERG et al. 2003; TARIOT et al., 2004; AREOSA et al., 2005, CHAVES et al., 2008).
Técnicas para verificar a atividade da Acetilcolinesterase
A modernização dos ensaios possibilitou a utilização de enzimas, receptores, DNA, entre outros alvos, para a avaliação rápida de grandes quantidades de amostras. Dentre os bioensaios rápidos e sensíveis, a avaliação da atividade da AChE é uma alternativa para detecção e seleção de amostras com atividade anticolinesterásica (TREVISAN et al, 2003). Como a cromatografia em camada delgada é uma técnica simples, rápida e barata, esta técnica é uma ferramenta muito útil para localizar atividade em misturas complexas, como extratos e frações obtidas de plantas.
Trevisan e Macedo (2003) descrevem o estudo de extratos (aquosos, hidroalcoólicos, etanólicos, metanólicos, acetato de etila, clorofórmio e hexano) de plantas pertencentes a diversos gêneros e famílias (Amburana, Anacardium, Auxemma, Bauhinia, Bowdichia, Cecropia, Cordia etanol , Croton, Datechampia, Egletes, Lippia, Lonchocarpus, Mimosa, Momordica, Paullinia, Philodendron, Plathymenia, Plathymiscium, Protium, Pterodon, Simarouba, Solanum, Triphasia, Vanilosmopsis, Verbezina, Vitex) que podem inibir a atividade da enzima AChE. A Tabela 1 mostra as plantas que obtiveram inibição da enzima AChE nos ensaios de microplaca e CCD. Inibição da atividade da enzima AChE por extratos vegetais brutos testados na microplaca (% de inibição) e CCD.
Quando a substância analisada inibe a AChE, a tendência é de redução da coloração amarela (Figura 4) e pode ser verificada por espectroscopia UV (PEREIRA; ADAMS; SILVA, 2004).
Material
Material Vegetal
Material e Reagentes
Equipamentos
Métodos
- Obtenção dos extratos
- Isolamento de metabólitos secundários no extrato de folhas e caules
- Isolamento de metabólitos secundários do extrato bruto dos frutos
- Ensaio Bioautográfico
- Ensaio “in vitro”
- Animais
- Preparação do material enzimático
- Ensaio Enzimático
- Análise estatística
A eluição iniciou com 100% H, depois utilizou misturas de Hex e AcOEt, aumentando gradativamente a polaridade e finalizando com 100% EtOH. A eluição começou com Hex, depois utilizou misturas de Hex e AcOEt, aumentando gradualmente a polaridade e terminando com 100% EtOH. Este foi denominado RF3A e apareceu como um sólido branco e era solúvel em acetona e diclorometano.
A fração 14-27 eluída com Hex:AcOEt (80:20) mostrou um único ponto de TLC quando revelado com anisaldeído de enxofre, este foi denominado RF4A e apareceu como um cristal solúvel em acetona. Na fração 50-61 (9 mg) eluída com Hex:AcOEt (7:3), o composto RF7A foi purificado e apareceu como um sólido amarelo, solúvel em acetona e DCM. A eluição iniciou com 100% Hex, seguida por misturas de Hex e AcOEt, aumentando gradualmente a polaridade, e terminando com 100% EtOH.
Nas frações 122 (8 mg) e mg) eluídas com DCM:ETOH (9:1), os compostos RF8A, que apareceu como um sólido amarelo solúvel em acetona, e RF9A, que apareceu como um sólido branco respectivamente, foram purificados solúveis em acetona. . A substância RF1B, que parecia um óleo amarelo e era solúvel em acetona e diclorometano, RF2B, que parecia um sólido branco, solúvel em acetona, e RF3B, que parecia um sólido amarelo, solúvel em acetona, foram transferidas para IV e RMN para elucidar suas estruturas. Nas frações mg) e 99 (42,3 mg), respectivamente, foram purificados os compostos previamente identificados como RF4B, que apareceu como um sólido amorfo solúvel em acetona, e RF5B, que apareceu como um sólido amarelo solúvel em acetona.
Nas frações 5-10 (3,2 mg) eluídas com Hex:AcOEt (9,5:0,5) e 133 (5,0 mg) eluídas com AcOEt:MeOH (9:1), foram purificadas as substâncias previamente identificadas, como RF6B que apareceu como um óleo solúvel em acetona e RF7B que se apresentou como um sólido amorfo solúvel em acetona e diclorometano VER CADERNO DE EXPERIMENTO As substâncias foram submetidas a IR e RMN para elucidação de sua estrutura.
Identificação das substâncias isoladas das folhas e caules da R
Identificação da substância RF1A
Os sinais de RMN de 1H e 13C são mostrados na Tabela 4 e são consistentes com dados da literatura para o ácido misinóico A. O ensaio bioautográfico foi realizado como um teste preliminar para verificar uma ação potencial dos extratos dos frutos, folhas e caules de Rapanea ferruginea na inibição a enzima AChE. A partir deste procedimento, foram descobertas possíveis substâncias que apresentavam inibição da AChE e após purificação foram submetidas a testes "in vitro".
80 µg de extratos de frutas, folhas e caule foram aplicados na placa CCD para identificar possíveis manchas brancas características da inibição da AChE (Figura 28). A Figura 32 mostra o CCD contendo espinasterol (32), no qual podem ser observadas manchas brancas de até 2,4 µg, características da inibição da AChE. A Figura 33 mostra dados de inibição de AChE em todo o cérebro e hipocampo, numa concentração de 44 µM.
Quando o método de Ellman e o tecido cerebral (cérebro inteiro, hipocampo e córtex) foram utilizados para realizar a avaliação, também houve inibição da atividade enzimática, embora ligeiramente diferente. A inibição da AChE pela escopoletina ocorreu no mesencéfalo, região do cérebro onde se encontram estruturas como o hipocampo e a amígdala, que estão envolvidas no processo de formação da memória. Verificou-se que na concentração de 80 µg houve inibição da AChE para todos os extratos brutos testados.
Quando as substâncias isoladas foram testadas, foi verificada inibição da AChE para os componentes ácido misinóico A, ácido mirsinóico B e espinasterol em concentrações de até 8 µg, 2 µg e 3,2 µg, respectivamente. Efeitos do metrifonato no declínio cognitivo na doença de Alzheimer: um estudo duplo-cego, controlado por placebo, de 6 meses. Projeções da doença de Alzheimer nos Estados Unidos e o impacto na saúde pública do atraso no início da doença.
